Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Chromogene in situ hybridisatie SS een hulpmiddel voor HPV-gerelateerde hoofd-en nek kankerdiagnose
Chapters
Summary June 14th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Humaan papillomavirus (HPV) RNA chromogene in situ hybridisatie wordt beschouwd als een van de gouden normen voor actieve menselijke papillomavirus infectie detectie binnen tumoren. Het staat de visualisatie van HPV E6-E7 mRNA uitdrukking met localisatie en semiquantitative evaluatie van zijn signaal toe.
Transcript
HPV RNA CISH maakt de detectie van een actieve infectie van het humaan papillomavirus mogelijk. Aangezien de in-situ hybridisatie doelen HPV RNA deze techniek maakt de visualisatie van een actieve transcriptie van het virus. Het heeft een nauwkeurige ruimtelijke resolutie en goede diagnose prestaties.
De detectie van HPV kan de diagnose van verschillende HPV-gerelateerde laesies ondersteunen, zoals orofaryngeale plaveiselcelcarcinoom of cervicale neoplasie. Het kan ook invloed hebben op de prognose. Na het voorbereiden van buffers en contra-kleuring reagentia, bereiden een x doel retrieval reagens in een groot bekerglas door het toevoegen van 70 milliliter van 10x doel retrieval reagens tot 630 milliliter gedestilleerd water.
Plaats het bekerglas op een verwarmingsplaat met magnetische roerder en bedek het met aluminiumfolie. Kook de inhoud op 100 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten om ervoor te zorgen dat het niet langer dan 30 minuten kookt. Om peroxidaseactiviteit op dia's met weefselsecties te blokkeren die eerder zijn gedeparaffiniseerd en in het schuifrek worden geplaatst, voegt u vier tot zes druppels toe, net genoeg om het monster te bedekken, van waterstofperoxide aan elke dia en 10 minuten bij kamertemperatuur uit te broeden.
Was de glijbanen twee keer twee minuten in gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Om RNA weefsel grenzen te breken in de RNA weefsel secties, verwijder eerst de aluminiumfolie uit de kokende een x TRR met behulp van een klauw, en stoppen met roeren. Dompel het schuifrek langzaam en zeer zorgvuldig onder.
Bedek het bekerglas opnieuw met de aluminiumfolie en broed gedurende 15 minuten uit. Gebruik de klauw om het hete schuifrek onmiddellijk over te brengen in een gedestilleerd waterbad en was het twee minuten. Was de glijbanen vervolgens in verse 100% ethanol gedurende twee minuten, en laat ze drogen op kamertemperatuur gedurende twee minuten.
Gebruik vervolgens een hydrofobe barrièrepen om een barrière rond elk monster te trekken en laat deze minstens vijf minuten uitdrogen. Voor protease spijsvertering, plaats de dia's in de vochtigheid gecontroleerde lade, en voeg ongeveer vier druppels Protease Plus per monster. Bedek de lade met een deksel, en steek het in de hybridisatieoven gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius.
Haal de lade uit de oven en verwijder het schuifrek. Werken een dia tegelijk, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de glijbaan rack ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met gedestilleerd water. Was de glijbanen twee keer twee minuten in gedestilleerd water bij kamertemperatuur met constante agitatie.
Als u de hybridisatie wilt starten, tikt u op de dia's en veegt u deze om overtollige vloeistof te verwijderen en plaatst u deze terug in het schuifrek. Verwijder de voorverwarmde HPV-sonde uit de oven en voeg ongeveer vier druppels toe om elke sectie volledig af te dekken. Bedek de lade met het deksel, en steek het in de oven voor twee uur op 40 graden Celsius.
Na het voltooien van de incubatie, haal de lade uit de oven en verwijder het schuifrek. Een dia per keer, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de schuifrek ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met een x wassen buffer, het wassen van de dia's gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met constante agitatie, en herhaal met verse een x wassen buffer. Tik en veeg om overtollige vloeistof uit de dia's te verwijderen en plaats ze opnieuw in het schuifrek.
Voeg ongeveer vier druppels kamertemperatuur AMP1 per sectie toe om elke sectie volledig af te dekken. Bedek de lade met het deksel, en steek het in de oven gedurende 30 minuten op 40 graden Celsius. Verwijder na het verwijderen van de lade uit de oven het schuifrek.
Werken een dia tegelijk, snel verwijderen van overtollige vloeistof, en plaats de dia in de dia rek ondergedompeld in een kleurplaat gevuld met een x wassen buffer, wassen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met constante agitatie, en herhaal met verse een x wassen buffer. Doe hetzelfde aantal druppels van elke DAB-A- en DAB-B-oplossing af in een buis van de juiste grootte om ongeveer 120 microliters DAB-substraat per sectie en vortex te maken. Neem elke dia, een voor een, uit het schuifrek, en tik en veeg om overtollige vloeistof te verwijderen, en plaats deze terug in het schuifrek.
Pipette ongeveer 120 microliter VAN DAB-mengsel op elke weefselsectie, ervoor te zorgen dat de secties worden afgedekt. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, en ga verder met contrastaining. Plaats een druppel montagemedium per glazen lat, en plaats vervolgens de lamellen op de glijbanen en laat ze luchtdrogen.
Na een paar uur, ga verder met de evaluatie met behulp van een optische microscoop zoals beschreven in het manuscript. Zoals hier beschreven in hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom, de aanwezigheid van bruine punctiform vlekken in het cytoplasma of in de kernen van tumorcellen gedefinieerd een positief geval. De resultaten werden verdeeld in twee scores, RNA CISH hoge en lage score zoals waargenomen met een 20x doelstelling.
RNA CISH score kleuring wordt beschouwd als laag wanneer waargenomen in minder dan 50% van de tumorcellen en beslaat minder dan 80% van het celoppervlak. Aan de andere kant, RNA CISH score is hoog wanneer waargenomen in meer dan 50% van de gekleurde kankercellen, of met de kleuring oppervlak meer dan 80%in meer dan 30% van de tumorcellen. Men moet nooit laten de dia's uitdrogen voor hybridisatie.
Vergeet niet de sonde voor te verwarmen. Voer voor elk monster een positieve en negatieve controle uit om de kwaliteit van het RNA te beoordelen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
