Genetics
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Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose
Chapters
Summary June 14th, 2019
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Die chromogene In-situ-Hybridisierung des humanen Papillomavirus (HPV) rna gilt als einer der Goldstandards für den aktiven Nachweis der Infektion durch das humane Papillomavirus in Tumoren. Es ermöglicht die Visualisierung der HPV E6-E7 mRNA-Expression mit Lokalisierung und semiquantitativer Auswertung seines Signals.
Transcript
HPV RNA CISH ermöglicht den Nachweis einer aktiven menschlichen Papilloma-Virusinfektion. Da die In-situ-Hybridisierung auf HPV-RNA abzielt, ermöglicht diese Technik die Visualisierung einer aktiven Transkription des Virus. Es hat eine präzise räumliche Auflösung und gute Diagnoseleistungen.
Der Nachweis von HPV kann die Diagnose mehrerer HPV-bedingter Läsionen unterstützen, wie z. B. oropharyngeale Plattenepithelkarzinom oder zervikale Neoplasie. Es kann auch einen Einfluss auf die Prognose haben. Nach der Vorbereitung von Puffern und Gegenfärbungsreagenzien ein x Ziel-Retrieval-Reagenz in einem großen Becher vorzubereiten, indem 70 Milliliter 10-faches Zielabrufreagenz zu 630 Milliliter destilliertem Wasser hinzugefügt werden.
Legen Sie das Becherglas auf eine Heizplatte mit Magnetrührer und bedecken Sie ihn mit Aluminiumfolie. Kochen Sie seinen Inhalt bei 100 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten, um sicherzustellen, dass es nicht länger als 30 Minuten kochen. Um die Peroxidase-Aktivität auf Dias mit zuvor deparaffinierten und im Diaregal platzierten Gewebeabschnitten zu blockieren, fügen Sie vier bis sechs Tropfen, gerade genug, um die Probe zu bedecken, Wasserstoffperoxid zu jedem Dia hinzu und inkubieren Sie sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur. Um DIE GRENZEN des RNA-Gewebes in den RNA-Gewebeabschnitten zu brechen, entfernen Sie zuerst die Aluminiumfolie mit einer Kralle aus der siedeten x TRR und hören Sie auf zu rühren. Tauchen Sie das Schiebegestell langsam und sehr sorgfältig ein.
Den Becher wieder mit der Aluminiumfolie bedecken und 15 Minuten bebrüten. Verwenden Sie die Kralle, um das heiße Schieberegal sofort in ein destilliertes Wasserbad zu übertragen und zwei Minuten lang zu waschen. Waschen Sie die Dias dann in frischem 100%Ethanol für zwei Minuten, und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für zwei Minuten trocknen.
Als Nächstes verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Barriere um jede Probe zu ziehen, und lassen Sie sie für mindestens fünf Minuten austrocknen. Zur Protease-Verdauung die Dias in das feuchtigkeitsgesteuerte Tablett legen und pro Probe etwa vier Tropfen Protease Plus hinzufügen. Bedecken Sie das Fach mit einem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Hybridisierungsofen ein.
Entfernen Sie das Fach aus dem Ofen, und entfernen Sie das Schiebegestell. Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in das Schieberegal in einer Färbeschale mit destilliertem Wasser gefüllt untergetaucht. Waschen Sie die Dias zweimal für zwei Minuten in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung.
Um die Hybridisierung zu starten, tippen und streichen Sie die Dias, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und legen Sie sie wieder in das Schiebeträger. Entfernen Sie die vorgewärmte HPV-Sonde aus dem Ofen, und fügen Sie etwa vier Tropfen hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel, und legen Sie es in den Ofen für zwei Stunden bei 40 Grad Celsius.
Nach Abschluss der Inkubation das Fach aus dem Ofen nehmen und das Schiebegestell entfernen. Eine Folie nach der anderen, schnell entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer gefüllt, waschen Sie die Dias für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Tippen und flicken, um überschüssige Flüssigkeit aus den Dias zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.
Fügen Sie etwa vier Tropfen Raumtemperatur AMP1 pro Abschnitt hinzu, um jeden Abschnitt vollständig abzudecken. Bedecken Sie das Tablett mit dem Deckel und legen Sie es 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in den Ofen ein. Nachdem Sie das Fach aus dem Ofen entfernt haben, entfernen Sie das Schiebeträger.
Arbeiten Sie eine Rutsche nach der anderen, entfernen Sie schnell überschüssige Flüssigkeit, und legen Sie die Rutsche in der Schiebestange in einer Färbeschale gefüllt mit einem x Waschpuffer, waschen für zwei Minuten bei Raumtemperatur mit konstanter Rührung, und wiederholen Sie mit frischen ein x Waschpuffer. Geben Sie die gleiche Anzahl von Tropfen jeder DAB-A- und DAB-B-Lösung in einem entsprechend großen Rohr aus, um ca. 120 Mikroliter DAB-Substrat pro Abschnitt und Wirbel herzustellen. Nehmen Sie jede Folie nacheinander aus dem Schiebeträger, tippen und flicken Sie, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie wieder in das Schiebegestell.
Pipette ca. 120 Mikroliter DAB-Mischung auf jeden Gewebeabschnitt, um sicherzustellen, dass die Abschnitte abgedeckt sind. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und mit der Gegenfärbung fortfahren. Legen Sie einen Tropfen Montagemedium pro Glaslatte, und legen Sie dann die Lamellen auf die Rutschen und lassen Sie sie lufttrocknen.
Nach einigen Stunden mit der Auswertung mit einem optischen Mikroskop, wie im Manuskript beschrieben, gehen Sie fort. Wie hier im Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom beschrieben, definierte das Vorhandensein von braunen punktförmigen Färbungen im Zytoplasma oder in den Kernen von Tumorzellen einen positiven Fall. Die Ergebnisse wurden in zwei Scores unterteilt, RNA CISH high und low score as observed with a 20x objective.
DIE Färbung des RNA-CISH-Scores wird bei weniger als 50 % der Tumorzellen als niedrig angesehen und deckt weniger als 80 % der Zelloberfläche ab. Auf der anderen Seite ist der RNA-CISH-Score hoch, wenn er in mehr als 50% der gefärbten Krebszellen beobachtet wird, oder mit der Färbefläche von mehr als 80% in mehr als 30% der Tumorzellen. Man sollte die Dias nie für die Hybridisierung austrocknen lassen.
Vergessen Sie nicht, die Sonde vorzuheizen. Führen Sie für jede Probe eine positive und negative Kontrolle durch, um die Qualität der RNA zu bewerten.
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