Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

Dessa protokoll kommer att hjälpa alla forskare införliva användningen av Drosophila cellinjer för att driva eller komplettera sin forskning dagordning. De flesta om inte alla Drosophila cellkulturer återuppliva, föröka sig, och cryo-bevara väl när de hanteras enligt dessa riktlinjer. Efter att ha torkat ner arbetsytan på en laminär flödeshuv med 70%etanol, dosera fem milliliter av lämpligt medium i en 25 centimeter i kvadrat T-kolv.

Torka av behållaren av frusen cellinje med 70%etanol och försiktigt lossa och unseal locket. Med hjälp av en Pasteur-pipett överför du en milliliter rumstemperaturmedium från kolven till kryoflaskan och blanda försiktigt för att tina de frusna cellerna. Var försiktig att cellupphängningen inte svämmar över, överför hela volymen av den tinade cellens suspension till kolven och skölj cryo-injektionsflaskan med färskt medium.

Låt cellerna lägga sig till botten av kolven i minst två timmar i en 25 grader celsius inkubator. Returnera inte frysta celler som har förpackats för resor tillbaka till minus 80 grader celsius frys under en längre period eller till flytande kväve. Tina istället cellerna ASAP.

Efter att ha bekräftat fastsättning i ett ljusmikroskop, byt försiktigt ut supernatanten med fem milliliter färskt medium innan kolven återsänds till inkubatorn. Alternativt, efter upptining, överför cellupphängningen till ett 15 milliliter koniskt rör för centrifuger och återuppstäng pelleten i fem milliliter färskt medium före sådd i en T-25-kolv som just visats. För att avgöra om cellerna är redo att passaged, undersöka morfologi och sammanflödet av kulturen under ett mikroskop.

Med tanke på celltätheten och fördubblingstiden, sista gången cellerna var subkulturerade, och eventuella tecken på mikroorganismal kontaminering i kulturen. Om kulturen verkar mycket konfluent, använd tio milliliter av kulturen supernatant för att försiktigt rubba cellerna från odlingsplattans botten och bestämma celltätheten genom att räkna antalet livskraftiga celler i den resulterande encellsupphängningen. Sub-kultur cellerna, om celltätheten är mellan fem till tio tider tio till sixthen celler per milliliter i det anslå medlet.

Tillsätt i minst en gånger tio till sjätte celler per milliliter koncentration i en ny odlingsplatta för att uppnå önskad sådd cell densitet. Täck sedan och märk plattorna med operatörens initialer, datum, delat förhållande, såddcelltäthet, celllinjeidentifierare, medium, passagenummer och eventuella medium tillägg såsom antibiotika, och placera plattorna i plastbehållare för deras fortsatta inkubation i 25 grader celsius inkubator. För att rubba vidhäftande celler bildar en 100 millimeters kultur skålen botten, först överföra alla supernatant i en steril kolv och skölj cellerna med en långsam tillsats av en milliliter av 0,05%trypsin EDTA.

Snurra försiktigt för att säkerställa att trypsinlösningen täcker hela tillväxtytan innan lösningen kasseras. Därefter lägger försiktigt en till två milliliter färska 0,05%trypsin EDTA till plattan och placera plattan i 25 graders celsius inkubator i tre till tio minuter. När cellskiktet kan observeras lossa och glida bort av odlingsytan, stoppa trypsinaktiviteten med tillsats av nio milliliter av den sparade supernatanten och blanda cellupphängningen noggrant för att separera cellklumparna.

När alla celler har rubbats, kommer den växande ytan att vara tydlig. För att räkna cellerna manuellt med hjälp av en Neubauer cellräkningssglas, torka först av ytan på en hemocytometer-glidning och täckglidning med 70 %alkohol. Efter blandning, tillsätt 15 mikroliter av cellerna i varje räfflad kant av hemocytometer för att fylla båda kamrarna.

Cellupphängningen kommer att dras in i räknekammaren genom kapillärverkan. Med hjälp av ett 10x mikroskop mål, räkna mellan 100 till 200 celler inom en millimeter kvadrat område i mitten av nätet bunden av de parallella linjerna. Upprepa sedan uppräkningen med den andra kammaren och använd medelvärdet av de två countsna för att bestämma celltätheten enligt formeln.

För Drosophila cellinje kryobevarande, åter upphäva cell pelleten i en volym av frysning medium som kommer att resultera i en slutlig celltäthet på minst fyra gånger tio till sjunde celler per milliliter. Tillsätt en lämplig volym av kryo-protectant, dimetylsulfoxid eller DMSO, i cellen suspension drop klokt så att den slutliga DMSO koncentrationen är 10%och försiktigt blanda cellen suspension. Därefter tillsätt försiktigt 0,5 milliliter alikvoter av cellen suspension i pre-märkta cryo-injektionsflaska och placera cryo-injektionsflaska i en frysning behållare fylld med isopropanol.

Överför sedan frysbehållaren till en frysbox med minus 80 grader över natten så att kryo-injektionsflaskans temperatur sjunker långsamt till frystemperaturen. Därefter snabbt överföra kryo-injektionsflaska till burkar för insättning i en flytande kvävebehållare. Alternativt kan du överföra de frysta kryo-injektionsflaskan till en färdigkyld frysbox och förvara de frysta kryo-injektionsflaskan i vätskefasen av en kvävefrys.

Sammanflödet av en cellinje kan bestämmas med ljusmikroskop. Snabbväxande cellinjer som når sammanflödet tidigt måste passaged regelbundet, upp till två gånger i veckan. Däremot kan långsamt växande celler passaged minst en gång varannan vecka eller längre, även om dessa celler måste matas färskt medium varje vecka.

Cellinjer som härrör från varierande vävnadskällor skiljer sig i deras morfologi, följsamhetsegenskaper, mediakrav och fördubblingstider. För kvantitativa experiment är cellräkning väsentligt. Cellerna kan räknas med hjälp av en hemocytometer eller en automatiserad partikelräknare.

Cellkonfluens är en visuell guide för när man ska subkultur för den erfarna operatorn. Cellräkning leder dock till ett förutsägbart subculturing schema och underlättar detektion av tillväxtavvikelser. Var försiktig och använd lämplig skyddsutrustning när du arbetar med flytande kväve.