Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering av Myoepithelial celler fra voksen murine Lacrimal og submandibular kjertler
Chapters
Summary June 11th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den lacrimal kjertel (LG) har to celletyper uttrykker α-glatte muskel utgangen (αSMA): myoepithelial celler (MECs) og pericytes. MECs er av ectodermal opprinnelse, finnes i mange kjertel vev, mens pericytes er vaskulær glatte muskelceller av endodermal opprinnelse. Denne protokollen isolerer MECs og pericytes fra murine LGs.
Transcript
Denne protokollen er betydelig fordi den tillater separasjon og isolering av to glatte muskelcellelinjer, myoepitheliale celler og pericytes. Denne metoden kombinerer genetisk merking av glatte muskelceller via celleoverflatemarkører for å rense populasjoner av myoepitheliale celler og pericytes. Denne protokollen tillater sammenligning av funksjonen og regenerative evnene til sunne og syke myoepitheliale celler og behandling av disse cellene for genuttrykksstudier.
Myoepithelial celler finnes i andre eksokrine kjertler som bryst, spytt og bukspyttkjertel, noe som gjør at denne protokollen kan tilpasses ved isolering av myoepithelial celler og pericytes fra andre vev. For å merke alfa glatt muskel actin eller SMA uttrykke celler, injisere tre til fire uker gamle tamoxifen-induserbar alfa SMA drevet reporter mus med 100 mikroliter tamoxifen per 20 gram kroppsvekt intraperitoneally en gang om dagen i to dager. For lakrylmalekjertelsamling, to til tre dager etter siste injeksjon, bruk pinsett til å forsiktig trekke en kjertel samtidig som du skraper bindevevet rundt kjertelen med den skarpe spissen av en liten saks for å frigjøre kjertelen.
Når lakrymal- og parotidkjertlene er separert, bruk saks til å kutte lakrymalkjertelen ut og legg kjertlene i en 35 millimeter tallerken med to milliliter kald PBS på is. Plasser parabolen under et dissekerende mikroskop og trim eventuelle omkringliggende fett og bindevev. Fjern deretter lakrymalkjertelkapselen med to tang.
Når alle kjertlene er høstet, sjekk et lite stykke vev under et fluorescerende mikroskop for å bekrefte cellemerking. For å forberede en encellede suspensjon, overfør alle lakrymalkjertlene til en 35 millimeter tallerken som inneholder 0,5 milliliter romtemperatur fordøyelsesmedium og bruk små saks til å hakke kjertlene i 0,2 til en mikrometer firkantet stykker. Ved hjelp av en bred bore pipette filter tips overføre hakket vev i en to milliliter rund bunn rør og bringe volumet i røret til to milliliter med fordøyelsesmedium.
Inverter røret for å blande, og plasser røret i en 37 graders celsius risting inkubator i 90 minutter ved 100 til 120 rotasjoner per minutt. Hvert 30. minutt triturater kjertelbitene sakte 20 til 30 ganger ved hjelp av 1000 mikroliter filterspisser med en avtagende borestørrelse. På slutten av hver triturasjon, inspiser en 10 mikroliter aliquot under et mikroskop for klynger.
Etter 90 minutter passerer prøven to til tre ganger gjennom en insulinsprøyte nål for å ytterligere frigjøre cellene i suspensjon og overføre celleoppløsningen til et 15 milliliter rør. Legg blokkering Medium Type 1 til totalt fem milliliter og bland røret to til tre ganger ved inversjon. Før cellene gjennom en 70 mikrometercellesil inn i et 50 milliliter rør, og vask silen med en milliliter blokkering av middels type 1, før du belaster cellene gjennom filteret en gang til.
Deretter samle cellene ved sentrifugering og resuspend pellet i to milliliter av blokkerer blokkering Medium Type 2. Overfør cellene til et to milliliter mikrocentrifugerør og samle cellene ved sentrifugering. Resuspend cellene i en milliliter Accutase løsning for en to til tre minutters inkubasjon ved 37 grader celsius og 100 til 120 rotasjoner per minutt.
På slutten av inkubasjonen, overføre cellene til en 50 milliliter tube og legge opp til 10 milliliter blokkering Medium Type 1. Etter sentrifugering resuspend cellene i seks milliliter utvinning medium for en 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, sjekk en 10 mikrolitersprøve under mikroskopet for å sikre fullstendig celledissosiasjon.
Etter telling, samle cellene ved sentrifugering. For å farge cellene for fluorescensaktivert cellesortering, eller FACS, legg til opptil fem ganger 10 til de fem cellene per to milliliter rør som inneholder 400 mikroliter FACS-buffer og legger til fem mikroliter brilliant violet 421 antimus CD326 og 0,5 mikroliter Ghost Red 780 Levedyktighetsfargestoff. Etter grundig blanding, pakk rørene med folie i en 45 minutters inkubasjon ved 4 grader celsius med rotasjon.
På slutten av inkubasjonen, samle cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellets i en milliliter FACS buffer per prøve. Overfør celleprøvene til individuelle fem milliliter FACS-rør på is og juster kompensasjonen ved hjelp av enkeltfargekontroller. Deretter sorterer cellene på 20 pounds per kvadrattomme gjennom en 100 mikrometerdyse.
Mikrovaskulære pericytes utvikle seg rundt veggene i kapillærer og demonstrere en firkantet form. Myoepithelial celler omgir lacrymal sekretorisk acini, har lange prosesser, og okkuperer et relativt stort område. Her vises celler som er dissosiert fra en lakrylmalekjertel som forberedelse til fluorescensaktivert cellesortering, som nettopp demonstrert.
For strømning cytometrisk sortering av myoepithelial celler og pericytes cellene bør først gated av sine fremover og side-scatter områder før unntatt noen doble. Etter gating for å utelukke de døde cellene, brukes kontrollprøver til å bestemme bakgrunnsstøyen og for å etablere en riktig kompensasjon for en optimal separasjon mellom signaler. Husk å holde antall kjertler og fordøyelsesmediumvolum som beskrevet i protokollen, og for å sjekke effektiviteten av vevsfordøyelsen på alle trinn.
De isolerte cellene kan brukes til flere nedstrøms program, inkludert in vivo /in vitro eksperimenter, for eksempel cellekultur, transplantasjon, metabolomics, proteomics, og encellede analyser.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
