Summary
Den lacrimal kjertel (LG) har to celletyper uttrykker α-glatte muskel utgangen (αSMA): myoepithelial celler (MECs) og pericytes. MECs er av ectodermal opprinnelse, finnes i mange kjertel vev, mens pericytes er vaskulær glatte muskelceller av endodermal opprinnelse. Denne protokollen isolerer MECs og pericytes fra murine LGs.
Abstract
Den lacrimal kjertel (LG) er en eksokrin tubuloacinar kjertel som utskiller en vandig lag av tåre film. The LG epitel treet består av acinar, ductal epitel, og myoepithelial celler (MECs). MECs uttrykke Alpha glatt muskel utgangen (αSMA) og har en kontraktile funksjon. De finnes i flere kjertel organer og er av ectodermal opprinnelse. I tillegg inneholder LG SMA + vaskulære glatte muskelceller av endodermal opprinnelse kalt pericytes: kontraktile celler som innhylle overflaten av vaskulære rør. En ny protokoll tillater oss å isolere både MECs og pericytes fra voksen murine LGs og submandibular kjertler (SMGs). Protokollen er basert på genetisk merking av MECs og pericytes bruker smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse belastning, etterfulgt av utarbeidelse av LG enkelt celle suspensjon for fluorescens aktivert celle sortering (FACS ). Protokollen gjør det mulig for separasjon av disse to celle populasjoner av ulik opprinnelse basert på uttrykket av epitel cellen vedheft molekyl (EpCAM) av MECs, mens pericytes ikke uttrykke EpCAM. Isolerte celler kan brukes til celle dyrking eller gen uttrykks analyse.
Introduction
Myoepithelial celler (MECs) er til stede i mange eksokrin kjertler inkludert lacrimal, spytt, harderian, svette, prostata og bryst. MECs er en unik celle type som kombinerer et epitel og en glatt muskel fenotype. MECs Express α-glatte muskel utgangen (sma) og har en kontraktile funksjon1,2. I tillegg til MECs, den lacrimal kjertel (LG) og submandibular kjertel (SMG) inneholder SMA + vaskulære celler kalt pericytes, som er celler av endodermal opprinnelse som innhylle overflaten av vaskulære rør3. Selv MECs og pericytes uttrykke mange markører, er sma den eneste markøren som ikke er uttrykt i andre LG og SMG celler1,3.
I løpet av de siste 40 årene har flere laboratorier rapportert om analyser for dissosiasjon av ulike eksokrin kjertel vev, der ikke-enzymatisk og enzymatisk tilnærminger ble anvendt. I en av de første rapportene publisert i 1980, Fritz og medforfattere beskrevet en protokoll for å isolere feline parotid acini bruker sekvensiell fordøyelse i en kollagenase/Trypsin løsning4. I 1989 justerte hann og medforfattere denne protokollen for acini isolering fra rotte LGs ved hjelp av en blanding av kollagenase, Hyaluronidase og DNase5. I 1990 publiserte Cripps og kolleger metoden for ikke-enzymatisk dissosiasjon av lacrimal kjertel acini6. Senere, i 1998, Zoukhri og medforfattere tilbake til en enzymatisk dissosiasjon protokoll for oppfølging ca2 +-IMAGING på LG og SMG isolert acini7. I løpet av det siste tiåret, har forskerne slått sitt fokus på isolering av stilk/stamceller fra eksokrin kjertler. Pringle og medforfattere beskrevet en protokoll i 2011 for isolering av musen SMG stamceller8. Denne metoden var basert på isolering av stilk cellen inneholder salispheres, som ble opprettholdt i kultur. Forfatterne hevdet at voksende celler uttrykker stilk cellen-assosiert markører kan være isolert fra disse salispheres8. Shatos og medforfattere publisert protokollen for stamcelleisolasjon fra uskadet voksen rotte LGs bruker enzymatisk fordøyelsen og samle "frigjort" celler9. Senere, i 2015, Ackermann og medforfattere justert denne prosedyren for å isolere presumptive "murine lacrimal kjertel stamceller" ("mLGSCs") som kan spres som en mono-lags kultur over flere passasjer10. Men ingen av de før nevnte prosedyrer tillatt for å skille cellulære under typer og individuelle bestander av isolerte epitelceller. I 2016 publiserte Gromova og medforfattere en prosedyre for isolering av LG-stammen/stamceller fra voksen murine LGs ved hjelp av FACS11. Imidlertid var denne protokollen ikke ment å isolere MECs.
Nylig har vi vist at vi er i stand til å isolere SMA + celler fra 3 uke gamle SMA-GFP mus12. Men på dette tidspunktet har vi ikke separert forskjellige populasjoner av SMA + celler. Her etablerte vi en ny prosedyre for direkte isolering av differensiert MECs og pericytes fra voksen LGs og SMGs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeidet ble utført i henhold til National Institute of Health (NIH) retningslinjer og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee of the Scripps Research Institute. Alle anstrengelser ble gjort for å minimere antall mus og deres lidelse. Alle eksperimentelle dyr fikk en standard diett med fri tilgang til vann fra springen.
Merk: De viktigste trinnene for MEC og pericyte isolasjon er skissert skjematisk i figur 1a-F. Alle reagenser og utstyr som brukes til denne prosedyren, er beskrevet i tabell 1.
1. mus og merking av SMA-cellene
- Bruk voksen (2-4 måneder gammel) Tamoxifen-induserbart, αSMA drevet reporter mus smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl.
Merk: Den smaCreErt2 stamme var vennlig levert av Dr. Ivo Kalajzic13. Rosa26-TdTomatofl/fl (B6. CG-gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze/J, også kjent som Ai9) stamme (# 007909) ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Sacramento, ca). SMA + celler ble merket av intraperitoneal Tamoxifen (TM) administrasjon. -
Utarbeidelse av Tamoxifen løsning
- Forbered filtrert mais olje. Bruk 0,22 μm vakuum filter siden mais olje er tyktflytende.
- Overfør 1 g TM-pulver fra flasken til en 50 mL slange. Tilsett 1 mL etanol til flasken, hetten og rist den for å skylle deretter legge til en 50 mL rør. Gjenta igjen med en annen 1 mL etanol.
- Legg til filtrert mais olje for å lage 50 mL av en 20 mg/mL TM-løsning. Vortex røret, Pakk den i folie, og legg den i en risting vannbad eller risting inkubator ved 45 ° c.
- Det kan ta ca 12-24 h å oppløse TM. Fra tid til annen, fjerne røret og se etter eventuelle gjenværende krystaller. Når TM er helt oppløst, alikvot og lagre ved-80 ° c. En tint alikvot kan gjenbrukes.
-
Hvis du vil merke SMA +-celler, injiserer du mus intraperitonealt (IP) med TM på to sekvensielle dager.
- Injiser 3-4 uker gamle smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f alle kjønns mus med TM ved 100 μL/20 g (eller 2 mg/20 g) kroppsvekt (figur 1a). Mus er klar til å brukes for celle isolasjon i 2-3 dager etter siste TM injeksjon. Om nødvendig kan injisert mus bli ofret ved lengre tidsperioder etter TM injeksjon.
Merk: Som kontroller for riktig kompensasjon under FACS, en vill type (C57Bl/6) mus og en smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse ikke injisert med TM (med "unstained" MECs) av samme alder ville være nødvendig. Bruk de samme beregningene som er gitt for 2 smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl mus. Ikke injisert smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl vil tillate evaluering av DSRed bakgrunn. Den C57Bl/6 musen vil tjene som en negativ kontroll av unstained celler.
- Injiser 3-4 uker gamle smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/f alle kjønns mus med TM ved 100 μL/20 g (eller 2 mg/20 g) kroppsvekt (figur 1a). Mus er klar til å brukes for celle isolasjon i 2-3 dager etter siste TM injeksjon. Om nødvendig kan injisert mus bli ofret ved lengre tidsperioder etter TM injeksjon.
2. løsninger og buffere
Merk: The LG er en epitel opprinnelse kjertel som inneholder en ekstracellulære matrise som gjør dissosiasjon av celler vanskelig. Derfor, ved hjelp av en spesiell kombinasjon av enzymer og en flertrinns fordøyelsen prosessen beskrevet nedenfor anbefales.
-
Dispase type II lagerløsning (25x)
- Løs opp 120 mg av dispase type II pulver i 2 mL 50 mM HEPES/150 mM NaCl for å fremstille en 25x lagerløsning (endelig konsentrasjon av dispase bør være 30 enheter/mL). Enheter per mg kan variere avhengig av antall mus og konsentrasjon av dispase bør justeres tilsvarende.
- Klargjør 200 μL alikvoter og oppbevar dem ved-70 ° c i opptil 6 måneder eller 4 ° c i flere dager. Ikke Frys/Tin alikvot av dispase mer enn én gang for å forhindre enzym forringelse.
-
DNase type I lagerløsning
- Oppløse 5 mg DNase type jeg pulver i en 5 mL oppløsning på 50% glyserol, 20 mM Tris buffer (pH 7,5), og 1 mM MgCl2 (Stock konsentrasjon bør være ca 2000 enheter/ml). Enheter per milligram kan variere avhengig av antall mus og dermed konsentrasjonen av DNase bør justeres tilsvarende.
- Filtrer lager løsningen med et 0,22 μm-filter og en 10 mL sprøyte.
- Klargjør 200 μL alikvoter og oppbevar dem ved-70 ° c i opptil 6 måneder eller 4 ° c i flere dager. Ikke fryse/tine mer enn én gang for å hindre enzym degradering.
-
Fordøyelse medium
- Til 10 mL DMEM lav glukose uten glutamin, tilsett 100 μL av cellekultur tilskudd (f.eks. Glutamax, se tabell over materialer) for en fortynning av 1:100.
- Til 2 mL DMEM lavt glukose med cellekultur supplement, tilsett 6 mg Kollagenase type I og bland grundig av pipettering (enzym på våt is), 160 μL av dispase lagerløsning (2,4 U/mL endelig konsentrasjon), 16 μL av DNase type I lagerløsning (8 U/mL endelig konsentrasjon) og 12 μL av 1 M CaCl2 (6 mm sluttkonsentrasjon).
Merk: Kalsium er nødvendig for å øke enzymatisk aktivitet14,15. Alle beregninger er gitt for isolering av celler fra fire lacrimal kjertler fra to voksne mus. Volumet av fordøyelsen medium kan variere avhengig av mengden av vev og antall replikerer. Ikke bruk mer enn 4 lacrimal kjertler fra 2-4 måneder gamle mus per 2 mL medium.
-
Blokkering medium jeg
- Til 25 mL DMEM/F-12, tilsett FBS (15% endelig konsentrasjon), 250 μL av cellekultur supplement (se tabell over materialer) for en fortynning av 1:100, og 50 μL av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm sluttkonsentrasjon).
Merk: Av de ulike typer medium som ble sammenlignet for denne protokollen DMEM/F-12 ga de beste resultatene. Dette mediet har også blitt brukt av andre forskere til å isolere/kultur epitelceller16,17.
- Til 25 mL DMEM/F-12, tilsett FBS (15% endelig konsentrasjon), 250 μL av cellekultur supplement (se tabell over materialer) for en fortynning av 1:100, og 50 μL av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mm sluttkonsentrasjon).
-
Blokkering av medium II
- Til 25 mL PBS, tilsett 50 μL av 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM sluttkonsentrasjon).
-
Recovery medium
- Til 2 mL HBSS supplert med 5 mM MgCl2, tilsett 100 ΜL av DNase type I lagerløsning til 100 U per 2 ml endelig konsentrasjon. Relativt høye konsentrasjoner av DNase-type I er nødvendig for å redusere aggregering av epitelceller.
-
Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) buffer
- Til 486,5 mL av PBS, tilsett 12,5 mL serum (2,5% endelig konsentrasjon) og 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM sluttkonsentrasjon).
Merk: Bufferen kan oppbevares ved 4 ° c i maksimalt 6 uker.
- Til 486,5 mL av PBS, tilsett 12,5 mL serum (2,5% endelig konsentrasjon) og 1 mL 0,5 M EDTA pH 8,0 (1 mM sluttkonsentrasjon).
3. voksen mus Lacrimal kjertel høsting og Microdissection
- Bedøve musen ved isoflurane inhalasjon (Juster isoflurane strømningshastighet eller konsentrasjon til 5% eller høyere) og offer ved cervical forvridning. Utføre anestesi og døds aktiv i henhold til institusjonelle IACUCs anbefalinger.
- Ved hjelp av fin tang og saks, fjerne huden mellom øyet og øret (figur 2a).
- Å analysere en LG, forsiktig rykk LG benytter pinsett og samtidig avlyse det binde tissue i nærheten det LG benytter det skarp tips av liten saks å ledig den (skikkelsen 2b).
- Unngå å skjære med saks, som LG og parotid spyttkjertler ligger svært nær hverandre og må skilles før disseksjon. Når LG og parotid kjortelen er adskilt, kutt det LG ut benytter saks. Legg kjertler i en 35 mm rett med 2 mL kald PBS (hold på isen) (figur 1B).
-
Som LG er dekket av en bindevev kapsel/konvolutt, trim noen omkringliggende fett og bindevev under en dissekere mikroskop og fjerne LG kapselen med to pinsett.
- Gjenta dette trinnet for alle kjertler.
- Kontroller et lite stykke vev under fluorescerende mikroskop for å sikre cellemerking (figur 1C).
4. utarbeidelse av LG single-Cell suspensjon
- Overfør alle LGs til en 35 mm rett med 0,5 mL romtemperatur (RT) fordøyelsen Media og hakke LGs bruke liten saks i svært små biter (ca 0,2 til 1 μm2). Normalt tar det ca 3 min til hakke 4 LGs (figur 2C).
- Overfør hakket vev inn i en 2 mL rund bunn rør med et bredt-bar pipette filter spissen. Bruk en normal størrelse pipette spissen med spissen avskåret (figur 2D).
- Tilsett opp til 2 mL fordøyelsen medium og bland ved invertere røret.
- Plasser røret i en risting inkubator (eller risting vannbad), ved 37 ° c, 100-120 RPM for 90 min.
- Hver 30 min sakte pipette stykker 20-30 ganger ved hjelp av en 1 000 μL filter spissen med synkende bore størrelse (figur 2D). Etter inkubasjons/trituration, ta en 10 μL alikvot og inspisere under et mikroskop for klynger. Hvis klynger vedvarer, fortsetter fordøyelsen.
- Etter 90 min., pass prøven 2-3 ganger gjennom en insulinsprøyte nål (31G) til ytterligere utslipp av celler til suspensjon.
Merk: Ingen synlige lacrimal kjertel brikkene skal forbli i løsningen når fordøyelsen er fullført (figur 1d). - Overfør celle fjæring til et 15 mL rør og Legg til blokkerende medietype I til sammen 5 mL. Vend røret 2-3 ganger for å blande.
- Pass cellen suspensjon gjennom en 70 μm celle sil plassert på en 50 mL tube. Vask sil med 1 mL blokkerende medietype I. Gjenta trinn 4,8 på nytt.
- Sentrifuge prøver ved 0,4 x g i 5 min ved RT.
- Aspirer supernatanten. Re-suspendere celler i 2 mL av blokkering medium type II ved hjelp av en 1 mL pipette spissen og overføre celle suspensjonen i en 2 mL mikrosentrifugen tube.
- Sentrifuger cellene ved 0,4 x g (24 x 1.5/2,0 ml rotor; se tabell over materialer) for 3 min ved RT.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere celler i 1 mL celle avløsning løsning (se tabell over materialer).
Merk: Her er cellen avløsning løsningen Accutase, en Marine-opprinnelse enzym med proteolytiske og collagenolytic aktivitet som løsner/dissociates celler for analyse av celleoverflaten markører. - Ruge celler ved 37 ° c, ved 100-120 RPM for 2-3 min. over-fordøyelse med celle avløsning løsning kan skade cellulære membraner.
- Overfør celle fjæring til et 50 mL rør og tilsett 10 mL blokkerings medium type I. sentrifugerør ved 0,4 x g (24 x 1.5/2,0 ml rotor; se tabell over materialer) i 5 min.
- Kast supernatanten og re-suspendere celler i 6 mL gjenopprettingsmedier og ruge celler i 30 min ved RT.
- Kontroller 10 μL av celle fjæring under mikroskopet for å sikre fullstendig celle dissosiasjon (Figur 3).
- Telle celler ved hjelp av en celle teller og Trypan blå. Normalt forventer vi 4 x 105-6 x 106 -celler fra fire LGs (ett utvalg).
- Sentrifuge celler ved 0,4 x g (24 x 1.5/2.0 ml rotor; se tabell av materialer) for 3 min ved RT og Fortsett til antistoff farging.
5. antistoff farging
- Legg opp til 5 x105 celler til et 2 ml rør som inneholder 400 ΜL av FACS buffer. Tilsett 5 μL brilliant Violet 421 anti-mus CD326 (EpCAM) og 0,5 μL av Ghost Red 780 (levedyktighet Dye).
- I parallell forbereder du Kontroller for å justere FACS-kompensasjon:
Negativ kontroll-1 (celler fra vill type mus)
Bakgrunn kontroll unstained celler fra smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl
Cy7-780 fargede celler (celler fra den ville typen mus beiset med Ghost Red 780 levedyktighet Dye)
EpCAM-brilliant Violet 421 (celler fra vill type mus beiset med EpCAM-brilliant Violet 421 antistoff).
Merk: For hver kontroll prøve bruke minimum 1 x 105 celler per 400 ΜL av FACS buffer. - Etter å ha lagt hver reagens Mix celler grundig av pipettering.
- Vikle rør (er) med folie og roter rør for 45 min ved 4 ° c.
- Sentrifuge prøver ved 0,4 x g (24 x 1.5/2,0 ml rotor; se tabell over materialer) i 3 minutter ved 4 ° c.
- Re-suspendere celler i 1 mL FACS buffer. Det er viktig å vaske celler for å redusere bakgrunnen under kompensasjon.
6. fluorescens aktivert celle sortering
- Overfør celle fjæring i 5 mL FACS-rør og fortsett med FACS-analyse. Hold cellene på isen.
- Juster kompensasjon ved hjelp av enkelt fargekontroller.
- Sorter celler ved 20 PSI gjennom et 100 μm munnstykke ved hjelp av passende strømnings flowcytometer (se tabell over materialer). Gating strategy18 er vist i figur 1e og Figur 4.
- Samle sorterte celler i medium, RNA-senere, FACS eller lyse buffere avhengig av nedstrøms prosedyrer (figur 1e, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musemodell for å isolere SMA + MECs og pericytes
Den etablerte protokollen tillater isolering av to rene populasjoner: MECs og pericytes fra LGs og SMGs (se tabell 1). Disse to typene celler har ulik størrelse og utseende. Mikrovaskulær pericytes, utvikle rundt veggene i blodkar (figur 5a) og har en firkantet form (figur 5B), mens MECs omgir LG sekretoriske acini, har lange prosesser og okkupere et relativt stort område (figur 5a, B ). Den beskrevne prosedyren er basert på genetisk cellemerking av SMA + i TM-induserbart smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl mus belastning. Additonally, EpCAM antistoffer tillate forskerne å skille epitel SMA+: EpCAM+ celler av ectodermal opprinnelse (MECs) og sma+EpCAM- celler av endodermal Origin (pericytes).
Tilberedning av enkelt celle fjæring
The LG inneholder en trådformede ekstracellulære matrise som må være fordøyd grundig. Den oppgitte protokollen tillater utarbeidelse av en enkelt celle løsning for FACS analyse og videre applikasjoner. Eksempel på dissosiert celler er vist i Figur 3.
MEC og pericyte isolert av FACS
For å skille MECs fra pericytes, ble enkeltceller farget med antistoffer mot EpCAM, som oppdager bare epitelceller. Den største populasjonen av celler ble bestemt av forover og side scatter området gating (figur 4a). Doublets ble ekskludert ved å plotte frem scatter området kontra bredde og med side scatter området kontra bredde (figur 4b). Dead Cell eksklusjon ble gjort via Ghost Red 780 (levedyktighet Dye) (figur 4c). En umerkede kontroll (figur 4e), bakgrunns kontroll og antistoff kontroll merket med et enkelt primært antistoff ble brukt til å bestemme bakgrunnsstøyen (ikke-spesifikk antistoff binding) og å etablere riktig kompensasjon for optimal separasjon mellom signalene (figur 4d). Data analyser ble utført ved hjelp av FlowJo programvare.
MECs og pericytes var inngjerdet av DsRed merking. DsRed+ Dim (ikke vist) og DsRed+ lyse celler innenfor både MEC og pericyte celle populasjoner ble oppdaget (figur 4d). Lysstyrken på merket celler kan avhenge av nivået av SMA uttrykk eller graden av reporter aktivering på TM injeksjon19. Bare DS Red+ Bright celle befolkning ble samlet inn siden bare helt differensiert celler var nødvendig. DS Red+ Dim celle populasjoner krever videre etterforskning.
Nedstrøms applikasjoner
Det er velkjent at MECs spiller en viktig kontraktile funksjon i eksokrin kjertler. Videre er de svært plast celler og har funksjoner av stamceller. Derfor kan isolerte MECs brukes i flere programmer. Celler kan for eksempel være kultivert, brukes til RNA-isolasjon eller transplantasjon (figur 1F)12,20,21,22.
| Parameteren | Lacrimal kjertel | Submandibular kjertel |
| Antall mus per utvalg | 2 | 1 |
| Antall kjertler per utvalg | 4 | 2 |
| Disseksjon kjertler | Atskilt fra parotid kjertel | Atskilt fra sublingual kjertel |
| Konsentrasjon av kollagenase per prøve | 6 mg/2 mL | 9 mg/2 mL |
| Omtrentlig celle nummer etter enzymatisk dissosiasjon | 4x105-6x105 | 9x105-1.5 x106 |
| Recovery trinn (se avsnittet "voksen mus Lacrimal kjertel single-Cell dissosiasjon", punkt 15) | Suspendere celler på nytt i 6 ml gjenopprettingsmedier | Suspendere celler på nytt i 12 mL gjenopprettingsmedier |
| Volum av FACS buffer under antistoff farging | 400 μL | 2 rør av 400 μL; Det er bedre å splitte cellene i to eller tre rør som hvert rør har ikke mer enn 6x105 |
Tabell 1: modifikasjoner av protokollen for isolering av celler fra submandibular kjertel (SMG). Tabellen beskriver store modifikasjoner som kreves for å isolere MECs og pericytes fra murine SMG i sammenligning med prosedyren for murine LG.
Figur 1: en skjematisk fremstilling av eksperimentet. (A) IP-injeksjoner av smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/flmus med TM. (B) isolering og HAKKING av LG eller SMG. (C) analyse av cellemerking ved hjelp av fluorescens mikroskop. (D) multi-Step enzymatisk fordøyelse å forberede en enkelt celle løsning. Det er viktig å sjekke fordøyelsen trinnene under et lett mikroskop for å sikre at cellene er frigitt fra klynger. (E) eksempel på GATING viser sma + lyse DS rød +/EpCAM + (MECs) og DS rød + Bright/EpCAM-(pericytes). (F) innsamlede MECs og pericytes kan bli utsatt for ulike nedstrøms prosedyrer inkludert celle DYRKING, RNA isolasjon og genuttrykk analyse og celle transplantasjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kritiske trinn av LG isolasjon/hakking. (A) fjerning av hud mellom øyet og øret for å analysere LG. stiplet gul sirkel angir LG-posisjon. (B) LG disseksjon. Gul pilspissen påpeker området mellom lacrimal og parotid kjertler. (C) LG hakking i fordøyelsen medium med saks med buede, Butte ender. (D) overføring av hakket vev i 2 ml rør. Gul pil spiss viser bred bore størrelse 1 ml spiss som kreves for overføring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: konfokalmikroskopi og differensial forstyrrelser kontrast (dic) bilder som illustrerer dissosiert enkeltceller fra MURINE LG. (A-C) enkeltceller isolert fra to LGs av en 4 måneders gamle smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse. Kjerner er farget med DAPI (blå). Hvite pilspisser angir SMA +-celler (DS Red): MECs eller pericytes. Scale bar = 15 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: identifisering av MURINE LG MECs og pericytes bruker FACS. (A) fastsettelse av den største BEFOLKNINGEN i LG celler ved fremover og side scatter området gating. (B) utelukkelse av doublets via frem scatter området kontra bredde. (C) Dead Cell eksklusjon via Ghost Red 780 (levedyktighet Dye). (D) MEC (sma+ Bright/EpCAM+) og Pericyte (sma+ Bright/EpCAM-) populasjoner kjennetegnes basert på farging med EpCAM antistoff. (E) umerkede kontroll (celler fra vill type mus). På hvert plott på% av gated celler er gitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: konfokalmikroskopi bilder som viser forskjellen i distribusjon og form mellom MECs og pericytes isolert fra MURINE LG. (A) hele Mount UTARBEIDELSE av LG med merket celler som viser forskjellen i fordelingen mellom MEC og pericytes. (B) FORMEN på MEC og pericyte er forskjellig. Pericyte er relativt liten og har squired form, mens MEC er stor og har uregelmessig form og flere lange prosesser. Pilspisser = MECs og pericytes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskrev en protokoll for MEC og pericyte isolering fra LG og SMG. Denne prosedyren var basert på genetisk merking av SMA, den eneste pålitelige biomarkør av MECs og pericytes.
Det haster å utvikle denne protokollen var motivert av nesten totalt fravær av litteratur fremhever isolering av MECs fra murine LGs og SMGs. Selv om genetisk merking ble tidligere brukt, ved hjelp av SMA-GFP mus for å isolere SMA + celler fra unge tre uker gamle LGs12, gjorde det ikke tillate bruk disse eldre mus for celle isolasjon på grunn av delvis tap av signal i voksen mus. I tillegg gir GFP-merket celler en relativt høy bakgrunn i FACS applikasjoner23 og krever ekstra kompensasjoner. I kontrast, smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse linje viser ingen eller en lav bakgrunn og høye nivåer av sma merking aktivisering gjennom musen postnatal utvikling, voksen alder og aldring. Bruk av smaCreErt2/+: Rosa26-TdTomatofl/fl Mouse er spesielt viktig for studier fokusert på sykdomsprogresjon eller aldring, siden sma + celler i disse musene kan merkes før sykdomsutvikling og studert senere når sykdom/aldring utvikler seg. En annen kritisk trinn i protokollen er grundig LG hakking og følgende fordøyelsen. Dette trinnet kan redusere celle nummeret innhentet under FACS analyse. Samlet, isolasjon og umiddelbar analyse av primær celler er også viktig på grunn av betydelige endringer i transcriptional profiler av celler opprettholdt i kultur24.
I tillegg muliggjør den beskrevne protokollen for MEC og pericyte isolering fra murine LGs forskjellige nedstrøms prosedyrer. Protein-, RNA-og DNA-utdrag er mulig fra både enkelt celle populasjoner, selv om flere mus/prøver må behandles parallelt eller sekvensielt for å øke antall celler. Til sammen viser de oppnådde resultatene en effektiv og relativt grei måte for MEC og pericyte isolering fra ulike murine kjertel vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser og ingen konflikter av andre interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Ivo Kalajzic for å gi oss med smaCreErt2 musen belastning, Ken Umazume for mus Tailing og genotyperingteknologi, Merk Shelley for å anskaffe profesjonelle bilder for figur 2. Vi takker også Scripps Council of Scientific Redaksjon og Merk Shelley for vitenskapelig engelsk redigering. Vi er takknemlige til The Scripps Research Institute Flow flowcytometri kjerne for hjelp med celle sortering og til Dr. Robin Willenbring for flere diskusjoner/råd om FACS dataanalyse.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health, National Eye Institute Grants 5 R01 EY026202 og 1 R01 EY028983 til H.P.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety Cabinet | SterilCard Baker | 19669.1 | Class II type A/B3 |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-910 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 10 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-908 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352196 | |
| 25 mL Disposable serological pipets | VWR | 89130-900 | Manufactured from polystyrene and are supplied sterile and plugged |
| 5 mL FACS round-bottom tubes | Fisher Scientific, Falcon | 14-959-11A | |
| 50 mL High-clarity polypropylene conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Antibiotic-antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| Appropriate filter and non-filter tips | Any available | Any available | |
| BD Insulin Syringes | Becton Dickinson | 328468 | with BD Ultra-Fine needle ½ mL 8 mm 31 G |
| BD Syringes 10 mL | Becton Dickinson | 309604 | Sterile |
| Brilliant Violet 421 anti mouse CD326 (EpCAM) | Biolegend | 118225 | Monoclonal Antibody (G8.8) |
| CaCl2 1M solution | BioVision | B1010 | sterile |
| Cell culture dishes 35 mm | Corning | 430165 | Non-pyrogenic, sterile |
| Collagenase Type I | Wortington | LS004194 | |
| Corn oil | Any avaliable | Any avaliable | From grocery store |
| Corning cell strainer size 70 μm | Sigma-Aldrich | CLS431751-50EA | |
| Digital Stirrer PC-410D | Corning | Item# UX-84302-50 | |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | |
| Dissecting scissors, curved blunt | McKesson Argent | 487350 | Metzenbaum 5-1/2 Inch surgical grade stainless steel non-sterile finger ring handle |
| DNase I | Akron Biotech, catalog number | AK37778-0050 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546-500ML | with 1,000 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 (DMEM/F12) | Millipore | DF-042-B | without HEPES, L-glutamine |
| Easypet 3 pipette controller | Eppendorf | 4430000018 | with 2 membrane filters 0.45 µm, 0.1 – 100 mL |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-500ML | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | 12-812 | |
| FlowJo version 10 | Any available | Any available | |
| Fluorescence binocular microscope Axioplan2 | Carl Zeiss | ID# 094207 | |
| Ghost Red 780 Viability Dye | Tonbo Biosciences | 13-0865-T100 | |
| GlutaMAX Supplement | ThermoFisher Scientific, Gibco | 35050061 | |
| Glycerol 99% | Sigma-Aldrich | G-5516 | |
| Hand tally counter | Heathrow Scientific | HEA6594 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma Millipore | H6648-500ML | Modified, with sodium bicarbonate, without calcium chloride, magnesium sulphate, phenol red. |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | With calcium, magnesium, no phenol red. |
| Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-51B | 02-671-51B |
| HEPES 1 M solution | ThermoFisher Scientific, Gibco | 15630-080 | Dilute 1/10 in ddH20 |
| HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | SH3007002E | |
| Hydrochloric Acid (HCl), 5 N Volumetric Solution | JT Baker | 5618-03 | To adjust Tris buffer pH |
| Innova 4230 Refrigerated Benchtop Incubator | New Brunswick Scientific | SKU#: | Shaker; 37 °C, 5% CO2 in air |
| Iris scissors | Aurora Surgical | AS12-021 | Pointed tips, delicate, curved, 9 cm, ring handle |
| Isoflurane Inhalation Anesthetic | Southern Anesthesia Surgical (SAS) | PIR001325-EA | |
| MgCl2 1 M solution | Sigma-Aldrich | 63069-100ML | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | ThermoFisher Scientific | 3451 | Clear, graduated, sterile |
| Microsoft Power Point | Any available | Any available | |
| NaCl powder | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Nalgene 25 mm Syringe Filters | Fisher Scientific | 724-2020 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| pH 510 series Benchtop Meter | Oakton | SKU: BZA630092 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Pure Ethanol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | |
| Red blood cell lysis buffer 10x | BioVision | 5831-100 | |
| Roto-torque Heavy Duty Rotator | Cole Parmer | MPN: 7637-01 | |
| Safe-lock round bottom Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf Biopur | 22600044 | PCR inhibitor, pyrogen and RNAse-free |
| Scissors | Office Depot | 375667 | |
| Sorting flow cytometer MoFlo Astrios EQ | Beckman Coulter | B25982 | With Summit 6.3 software |
| Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002441 | All centrifugation performed at RT |
| Sorvall RT7 Plus Benchtop Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | ID# 21550 | RTH-750 Rotor. All centrifugation performed at RT |
| Stemi SV6 stereo dissecting microscope | Carl Zeiss | 455054SV6 | With transmitted light base |
| Tamoxifen | Millipore Sigma | T5648-1G | |
| Trizma base powder | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypan blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Two Dumont tweezers #5 | World Precision Instruments | 500342 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm tips |
| Upright microscope | Any available | Any available | With transmitted light base |
| Vacuum filtration systems, standard line | VWR | 10040-436 | |
| Variable volume micropipettes | Any available | Any available |
References
- Makarenkova, H. P., Dartt, D. A. Myoepithelial Cells: Their Origin and Function in Lacrimal Gland Morphogenesis, Homeostasis, and Repair. Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 115-123 (2015).
- Haaksma, C. J., Schwartz, R. J., Tomasek, J. J. Myoepithelial cell contraction and milk ejection are impaired in mammary glands of mice lacking smooth muscle alpha-actin. Biology Of Reproduction. 85 (1), 13-21 (2011).
- Siedlecki, J., et al. Combined VEGF/PDGF inhibition using axitinib induces alphaSMA expression and a pro-fibrotic phenotype in human pericytes. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. , (2018).
- Fritz, M. E., LaVeau, P., Nahmias, A. J., Weigel, R. J., Lee, F. Primary cultures of feline acinar cells: dissociation, culturing, and viral infection. American Journal of Physiology. 239 (4), G288-G294 (1980).
- Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 145-158 (1989).
- Cripps, M. M., Bromberg, B. B., Bennett, D. J., Welch, M. H. Structure and function of non-enzymatically dissociated lacrimal gland acini. Current Eye Research. 10 (11), 1075-1080 (1991).
- Zoukhri, D., Hodges, R. R., Rawe, I. M., Dartt, D. A. Ca2+ signaling by cholinergic and alpha1-adrenergic agonists is up-regulated in lacrimal and submandibular glands in a murine model of Sjogren's syndrome. Clinical Immunology and Immunopathology. 89 (2), 134-140 (1998).
- Pringle, S., Nanduri, L. S., van der Zwaag, M., van Os, R., Coppes, R. P. Isolation of mouse salivary gland stem cells. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
- Ackermann, P., et al. Isolation and Investigation of Presumptive Murine Lacrimal Gland Stem Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
- Gromova, A., et al. Lacrimal Gland Repair Using Progenitor Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2017).
- Hawley, D., et al. Myoepithelial cell-driven acini contraction in response to oxytocin receptor stimulation is impaired in lacrimal glands of Sjogren's syndrome animal models. Scientific Reports. 8 (1), 9919 (2018).
- Matic, I., et al. Quiescent Bone Lining Cells Are a Major Source of Osteoblasts During Adulthood. Stem Cells. 34 (12), 2930-2942 (2016).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Eckhard, U., Schonauer, E., Brandstetter, H. Structural basis for activity regulation and substrate preference of clostridial collagenases. G, H, and T. Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20184-20194 (2013).
- Breggia, A. C., Himmelfarb, J. Primary mouse renal tubular epithelial cells have variable injury tolerance to ischemic and chemical mediators of oxidative stress. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 1 (1), 33-38 (2008).
- Mueller, S. O., Clark, J. A., Myers, P. H., Korach, K. S. Mammary gland development in adult mice requires epithelial and stromal estrogen receptor alpha. Endocrinology. 143 (6), 2357-2365 (2002).
- Guthmiller, J. J., Zander, R. A., Butler, N. S. Measurement of the T Cell Response to Preerythrocytic Vaccination in Mice. Methods in Molecular Biology. 1325, 19-37 (2015).
- Seime, T., et al. Inducible cell labeling and lineage tracking during fracture repair. Development, Growth & Differentiation. 57 (1), 10-23 (2015).
- Hawley, D., et al. RNA-Seq and CyTOF immuno-profiling of regenerating lacrimal glands identifies a novel subset of cells expressing muscle-related proteins. PLoS One. 12 (6), e0179385 (2017).
- Tata, A., et al. Myoepithelial Cells of Submucosal Glands Can Function as Reserve Stem Cells to Regenerate Airways after Injury. Cell Stem Cell. 22 (5), 668-683 (2018).
- Song, E. C., et al. Genetic and scRNA-seq Analysis Reveals Distinct Cell Populations that Contribute to Salivary Gland Development and Maintenance. Scientific Reports. 8 (1), 14043 (2018).
- Knight, A. ndrewW., B, N. Distinguishing GFP from cellular autofluorescence. Biophotonics International. 8 (7), 7 (2001).
- Januszyk, M., et al. Evaluating the Effect of Cell Culture on Gene Expression in Primary Tissue Samples Using Microfluidic-Based Single Cell Transcriptional Analysis. Microarrays (Basel). 4 (4), 540-550 (2015).
