Oversette ribosom affinitet rensing (TRAP) for RNA Isolation fra endothelial celler in vivo

Hei, jeg er Bin Ren, jeg er førsteamanuensis i kirurgi og biomedisinsk teknikk ved University of Alabama the Birmingham School of Medicine. Vårt laboratorium er interessert i endotelcellebiologi funksjon angiogenese akuogenese i sammenheng med disse vanlige hjerte-og karsykdommer og kreft. En av våre forskningsfokus er på epigenetisk og transkripsjon regulering av endotelcelletransdifferentiation og angiogenese.

For å forstå transkripsjonsmekanismene for angiogenese, har vi etablert transgene konstruerte muselinjer, der vi ikke bare har slettet et bestemt gener forbundet med angiogenese i endotelcellene, men en forbedret GFP-sonde vil bli genetisk merket på en ribosom av innfødte endotelceller. På denne måten kan vi isolere og rense løkker av tilhørende messenger RNA fra endotelceller i forskjellige vevsorganer direkte hos transgene dyr. Vi kan deretter bruke renset messenger RNA for nedstrøms analyse av transkripsjoner og transkripsjon.

Ved RNA sekvensering og sanntid chill PCR. I denne videoen vil mine studenter Patrick Moran og Jordan Palmer og forskningsteknikerne Nicholas Barnekow og Rong Yuan vise deg en tilnærming genotyping transgene mus og aspirerende budbringer RNA direkte fra endotelet i transgene dyr. Genotyping er en viktig foreløpig i denne protokollen for å sikre at isen har GFP-koden på ribosomene til endotelceller.

Siden alle nedstrøms RNAi isolasjonstrinn er avhengige av tilstedeværelsen av GFP-merkede ribosomer, er det viktig å bestemme genotypen før eksperimentet begynner. Før RNA-isolasjonen begynner, må flere forberedende trinn fullføres. Disse inkluderer buffer forberedelse og binding anti-GFP antistoff til protein G dina perler.

Bufferne kan vare opptil en måned ved fire grader Celsius og antistoffbundne perler kan vare opptil en uke ved fire grader Celsius. Så ta hensyn til disse begrensningene når du planlegger eksperimentet. Ved hjelp av en molardrevet homogenisator er en utmerket måte å øke RNA-utbyttet på.

Pass på at du bruker lavere frekvensinnstillinger og varigheter for å redusere RNA-nedbrytning. Som nevnt tidligere, genotyping er et viktig foreløpig skritt i prøveprotokollen. Å sikre at mus hvis RNA skal isoleres ved hjelp av TRAP-teknikken er positive for TRAP-genet, er i det minste heterozygotes, men ideelt homozygogous for TRAP-genet er et viktig skritt fordi det å sikre at GFP-taggen er på ribosomet er viktig for å trekke ned ved hjelp av antistoffreaksjonen og anti-GFPs du vil ha forberedt før du begynner eksperimentet.

Isoler ønsket vev fra musen og legg det umiddelbart i en iskald PBS med 100 mikrogram per milliliter cyklohekamidløsning. Dette sikrer at oversettelsen vil bli stoppet og at transkripsjonen vil være en nøyaktig skildring av musen før eutanasi. Bruk en motordrevet homogenisator til å homogenisere vevet til en cellefjæring.

Ideelle timing- og frekvensinnstillinger må bestemmes av det enkelte laboratoriet basert på den bestemte motordrevne homogenisatoren du skal bruke. Bruk av for høy frekvensinnstilling kan føre til RNA-nedbrytning og forstyrre resten av protokollen. Suspender cellepelleten i lysisbufferen du burde ha forberedt før eksperimentet startet.

Sørg for å homogenisere denne blandingen ytterligere for å sikre tilstrekkelig homogenisering før du fortsetter med resten av protokollen. Sentrifuger homogenatet i 10 minutter ved 2000 ganger G i en fire grader Celsius sentrifuge. Dette vil pellet kjernene og store cellulære rusk som kan forstyrre nedstrøms immunprecipitation reaksjon.

Legg DHPC og CA-630 lipider til supernatant fra forrige sentrifugalisering trinn. Disse lipidene vil bidra til å skille proteinfasene ut fra de andre intracellulære komponentene. Plasser fjæringen på isen i fem minutter og la den sitte.

Sentrifuger lysatet i 10 minutter ved 13 000 ganger G for å pellet noe oppløselig materiale. Hold 15% av klar lysate for fremtidige trinn. Tilsett anti-GFP antistoffbundne perler til cellelylat supernatant og inkuber blandingen ved fire grader Celsius med ende over enderotasjon i 30 minutter.

Det er her anti-GFP antistoffer vil binde GFP merkede ribosomer, slik at vi kan ytterligere isolere RNA fra disse ribosomene. Samle perlene på magnetstativet og vask perlene fem ganger ved hjelp av din høye saltpolysomvaskbuffer som du vil ha forberedt før du begynner isolasjonen. Fortsett umiddelbart til neste trinn der du vil plassere perlene i RLT-bufferen.

Sentrifuger lysatet i tre minutter med full hastighet og fjern forsiktig supernatanten og overfør det til et nytt mikrodrivstoffrør. Tilsett ett volum på 70% etanol til det ryddet lysate og bland umiddelbart ved pipettering. Fortsett umiddelbart til neste trinn der du vil overføre opptil 700 mikroliter av prøven, inkludert eventuelle bunnsplitt som kan ha dannet seg, til en spin-kolonne plassert i et to milliliter oppsamlingsrør.

Sentrifuger lysatet i 15 sekunder på mer enn 8000 ganger G for å vaske spin kolonnemembranen. Kast flyten gjennom og gå videre til neste trinn. Legg til 350 mikroliter buffer RW1 i spin-kolonnen.

Sentrifuge i 15 sekunder på mer enn 8000 ganger G for å vaske spin kolonnemembranen og kaste strømmen gjennom. Gjenta dette trinnet ved hjelp av ytterligere 350 mikroliter buffer RW1 før du går videre til neste trinn. Legg til 500 mikroliter buffer-RPE i spin-kolonnen.

Sentrifuge i 15 sekunder på mer enn 8000 ganger G for å vaske spin kolonne membran. Kast flyten gjennom og fortsett å gjenta dette trinnet ved å legge til ytterligere 500 mikroliter buffer RPE i spin-kolonnen. Denne gangen, sentrifuge i to minutter på mer enn 8.000 ganger G å vaske spin kolonne membran.

Kast strømmen gjennom og plasser spin-kolonnen i et nytt to milliliter oppsamlingsrør og fortsett til sentrifuge med full hastighet i ett minutt for å fjerne eventuelle restbuffer som kan være til stede på spin-kolonnen. Kast strømmen gjennom og plasser spin-kolonnen i et nytt 1,5 milliliter oppsamlingsrør. Fortsett å legge til 30 til 50 mikroliter RNase fritt vann direkte til spin-kolonnemembranen.

Sentrifuge i ett minutt på mer enn 8000 ganger G for å elute RNA fra spin kolonne membran. På dette punktet er RNA oppløst i RNase fritt vann og kan lagres på minus 80 grader Celsius i opptil ett år. Fortsett å kvantifisere og kontrollere renheten til RNA du har isolert ved hjelp av et spektrofotometer.

Du leter etter en topp på 260 nanometer, som er nukleinsyre, inkludert RNA, absorberer maksimalt. Mengden er avbildet i nedre høyre del av bildet i nanograms per mikroliter. Kvalitet kan utledes av 260 230-forholdet som vises ett element over antallet i nedre høyre del av skjermen.

Vår tilnærming viste lave RNA-avlinger, spesielt når vi renset mRNA fra hjertevevet eller fra tidligere frosne vev. Vi må dermed velge betingelsene for å øke utbyttet. Vi observerte imidlertid i EC-spesifikke CD-36 mangelfulle mus, nivået av efrin B2 og DLL4 ble betydelig økt i både lunge- og hjerteendothelia, sammenlignet med kontrollen.

Disse resultatene var konsistente med våre tidligere in vitro-studier, noe som tyder på at RNA-kvaliteten er tilstrekkelig for nedstrømsanalyse. Avkastningen var lav på grunn av de strenge forholdene i vårt arbeidsområde. For å overvinne denne begrensningen er det viktig å sette opp en RNase fri arbeidssone og dekontaminere arbeidsflater og utstyr som kan bli forurenset med RNase og bytte hansker ofte for å trekke ut kvalitet RNA og øke utbyttet.

Det er også viktig å finne egnede konsentrasjoner av GFP-antistoffer i affinitetsmatrisen og bruke passende konsentrasjoner av RNase-hemmer i vevslysbufferen og bruke RNase-fri plastppati og reagenser for RNA-ekstraksjon fra endotel ribosomer av de målrettede vevene.