Immunology and Infection
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माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर का अध्ययन करने के लिए एक संक्रमण मॉडल के रूप में इनवर्टेब्रेट गैलेरिया मेलोनेला का उपयोग
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गैलेरिया मेलोनेला हाल ही में माइकोबैक्टीरियम तपेदिक परिसर के लिए एक पुनरुत्पाद्य, सस्ते, और नैतिक रूप से स्वीकार्य संक्रमण मॉडल के रूप में स्थापित किया गया था। यहाँ हम वर्णन और bioluminescent माइकोबैक्टीरियम बीवीजी बीसीजी लक्स के साथ जी melonella के सफल संक्रमण स्थापित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन और प्रदर्शन.
Transcript
यह प्रोटोकॉल तपेदिक का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक संक्रमण मॉडल के रूप में गैलेरिया मेलोनेला के उपयोग का वर्णन करता है, जिससे अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले स्तनधारी मॉडलों की संख्या कम हो गई है। चूहों जैसे पारंपरिक स्तनधारी मॉडलों की तुलना में, गैलेरिया मेलोनेला तपेदिक का अध्ययन करने के लिए एक सस्ता, नैतिकता की दृष्टि से स्वीकार्य और अधिक सुलभ मॉडल है। इसके अलावा इस मॉडल के अनुकूलन उंमीदवार एंटीमाइकॉबैक्टीरियल दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देगा और तपेदिक के लिए तत्काल आवश्यक उपन्यास चिकित्सा के विकास में योगदान देगा ।
गैलेरिया मेलोनेला में स्तनधारियों की तुलना में एक जटिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली होती है। मेजबान-रोगजनक बातचीत के अध्ययन से तपेदिक में जन्मजात प्रतिरक्षा की भूमिका का और पता चल सकता है । एक संक्रमण मॉडल के रूप में गैलेरिया मेलोनेला का उपयोग तपेदिक तक ही सीमित नहीं है और पिछले एक दशक में अन्य जीवाणु और फंगल रोगजनकों के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया गया है।
शुरू करने के लिए, माइकोबैक्टीरियम बोविस बीसीजी लक्स के एक जमे हुए 1.2-मिलीलीटर ग्लाइस्रोल स्टॉक को डिफ्रॉस्ट करें, मॉन्ट्रियल वैक्सीन तनाव लस्बास जीन ले जाने वाले शटल प्लाज्मिड पीएसएमटी1 के साथ बदल गया। एक लेबल २५०-मिलीलीटर Erlenmeyer flask में, एक defrosted १.२-BCG लक्स के मिलीलीटर aliquot के साथ मिडलब्रुक 7H9 शोरबा के 15 मिलीलीटर टीका । एक सील बायोसेफ्टी कंटेनर में फ्लास्क रखें और 72 घंटे के लिए 220 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, ल्यूमिनोमीटर ट्यूब, भंवर में फॉस्फेट-बफर नमकीन में संस्कृति के 1:10 कमजोर पड़ने तैयार करें, और ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों को ल्यूमिनोमीटर में लोड करें। सब्सट्रेट 1% एन-डेसिल एल्डिहाइड को पूर्ण इथेनॉल में इंजेक्टर प्लेटफॉर्म में लोड करें और बायोल्यूमिनेसेंस को मापें। बीसीजी लक्स संस्कृति के विकास को रोकने के लिए बायोल्यूमिनेसेंस को कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों में परिवर्तित करें।
कोशिकाओं को गोली मारने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2, 175 बार जी पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र पर संस्कृति स्थानांतरित करें। ज्ञात माइकोबैक्टीरिडल गतिविधि के साथ एक उपयुक्त कीटाणुनाशक में सुपरनेट्ट को त्यागें। बैक्टीरियल क्लंपिंग को रोकने के लिए 10 मिनट के लिए 2, 175 बार जी पर अपकेंद्री द्वारा पीबीएस-टी के 50 मिलीलीटर में सेल पेलेट को दो बार धोएं।
अंतिम धोने के बाद, अपशिष्ट सुपरनैक्टेंट को कम करें और वांछित सेल घनत्व में माइकोबैक्टीरियल निलंबन को पतला करने के लिए पीबीएस-टी की आवश्यक मात्रा में माइकोबैक्टीरियल सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। इसके बाद पीबीएस-टी का इस्तेमाल करते हुए 24-वेल प्लेट्स में इनोकुलम के 10 गुना सीरियल कमजोर करने की तैयारी करें । इनोकुलम सीएलयू की गणना करने के लिए डुप्लिकेट में मिडलब्रुक 7H11 एगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर बाहर प्लेट करें।
खरीद के एक सप्ताह के भीतर आगमन और उपयोग पर 18 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में खरीदे गए इंस्टार लार्वा को बनाए रखें। एक समान क्रीम रंग, उचित आकार और वजन, उच्च गतिशीलता, और जब खत्म हो जाता है तो खुद को सही करने की क्षमता रखने के आधार पर प्रयोग के लिए स्वस्थ लार्वा की पहचान और चयन करें। कुंद अंत चिमटी का उपयोग करना, ध्यान से एक पेट्री फिल्टर कागज की एक परत के साथ लाइन में खड़ा पकवान में स्वस्थ लार्वा गिनती और उपयोग तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर स्टोर ।
एक फ्लैट, उठाया सतह के लिए एक ९४ मिलीमीटर व्यास परिपत्र फिल्टर पेपर टेप द्वारा इंजेक्शन मंच तैयार करें । बाँझ पीबीएस-टी के तीन खंडों के साथ स्टरलाइज, डिस्कार्ड और आगे कुल्ला करने के लिए 25 माइक्रोलीटर माइक्रोसिरिंग में 70% इथेनॉल के तीन वॉल्यूम को एस्पिरेट करें। फिर, तैयार बीसीजी लक्स इनोकुलम को फिर से खर्च करें और 10 माइक्रोलीटर को निष्फल माइक्रोसिरिंग में असंयमित करें।
नकारात्मक नियंत्रण के लिए पीबीएस-टी को एस्पिरेट करने के लिए एक अलग सिरिंज का उपयोग करें। 10 इंजेक्शन के बाद, एक समान सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए बीसीजी लक्स इनोकुलम को फिर से खर्च करें। एक लार्वा लेने और इंजेक्शन मंच पर जगह करने के लिए चिमटी का उपयोग करें।
मंच पर, लार्वा को अपनी पीठ पर पलटें और चिमटी के साथ सिर और पूंछ को सुरक्षित करके स्थिर करें। लार्वा के सिर से नीचे गिनते हुए अंतिम बाएं प्रोलेग का पता लगाएं और ध्यान से क्षैतिज विमान में 10 से 20 डिग्री कोण पर पांच से छह मिलीमीटर गहरी सुई की नोक डालें। सिरिंज से इनोकुलम इंजेक्ट करें।
प्रत्येक संक्रमण के बाद, संक्रमित लार्वा को फिल्टर पेपर की एक परत के साथ लाइन में खड़ा पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। एक एकल 94 मिलीमीटर पेट्री डिश 30 लार्वा तक समायोजित कर सकती है। पेट्री डिश को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर के अंदर एक वेंटेड, डार्क बॉक्स में स्टोर करें।
हर 24 घंटे में लार्वा के अस्तित्व की निगरानी करें। लार्वा को मृत माना जाता है जब वे छूने के जवाब में स्थानांतरित करने में विफल रहते हैं। अस्तित्व को रिकॉर्ड करें और मैनटेल-कॉक्स परीक्षण के साथ सांख्यिकीय महत्व का आकलन करें।
हर 24 घंटे में, बेतरतीब ढंग से पांच संक्रमित लार्वा का चयन करें और लार्वा सतहों को धीरे से निष्फल करने के लिए 70% इथेनॉल में भिगोए गए कपास कली झाड़ू का उपयोग करें। लार्वा को व्यक्तिगत रूप से बाँझ पीबीएस के 800 माइक्रोलीटर युक्त दो मिलीलीटर lysing मैट्रिक्स ट्यूबों में रखें। फिर, छह मीटर प्रति सेकंड पर 60 सेकंड के लिए लार्वा को समरूप बनाने के लिए एक समरूप का उपयोग करें।
लिड से समरूप को हटाने के लिए पांच सेकंड के लिए 3, 500 बार जी पर लिसिंग ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और व्यक्तिगत रूप से पांच बाँझ ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों में समरूप को सावधानी से डिकंट करें। एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में समरूप के 100 माइक्रोलीटर आरक्षित करें। पीबीएस-टी के एक मिलीलीटर और पिपेट के साथ lysing मैट्रिक्स ट्यूबों को इसी ल्यूमिनोमीटर ट्यूबों में धोने के द्वारा किसी भी शेष समरूप को ठीक करें।
भंवर ल्यूमिनोमीटर ट्यूब और एक ल्यूमिनोमीटर पर समरूपता के बायोल्यूमिनेसेंस को मापने। फिर, पीबीएस-टी का उपयोग करके 24-वेल कल्चर प्लेटों में समरूप के आरक्षित 100 माइक्रोलीटर के 10 गुना धारावाहिक कमजोर करने को तैयार करें। प्रत्येक मिडलब्रुक 7H11 आगर प्लेट पर कमजोर पड़ने के पिपेट 10 माइक्रोलीटर और प्रसार करने के लिए एक बाँझ प्लेट स्प्रेडर का उपयोग करें।
दो सप्ताह के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । उसके बाद, कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गिनती करें। वीवो संक्रमण में निम्नलिखित बीसीजी लक्स के सीएफयू अनुपात को आरएलयू निर्धारित करें।
इस प्रयोग में, बीसीजी लक्स खुराक पर निर्भर उग्रता एक ९६ घंटे की इनक्यूबेशन अवधि में G.mellonella लार्वा में मनाया गया था । ५०% लार्वा मृत्यु दर के लिए आवश्यक घातक खुराक सात सीएलयू की शक्ति के लिए एक गुना 10 होना निर्धारित किया गया था । नियंत्रण समूहों PBS-टी की एक 10 माइक्रोलीटर खुराक के साथ इंजेक्शन या उन बस चुभती नकली सुई चोटों लार्वा स्वास्थ्य को प्रभावित नहीं किया या मृत्यु दर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व ।
बीसीजी लक्स की सात सीएफयू खुराक की शक्ति के लिए दो बार 10 से संक्रमित लार्वा के लिए, लार्वा पृष्ठीय रेखा का मेलनीकरण संक्रमण के बाद 48 घंटे से मनाया गया और संक्रमण के बाद 96 घंटे से प्रणालीगत मेलनाइजेशन देखा गया। बीसीजी लक्स की सात सीएफयू खुराक की शक्ति के लिए एक बार 10 के साथ संक्रमण के परिणामस्वरूप संक्रमण के बाद पहले 72 घंटों के भीतर बायोल्यूमिनेसेंस की प्रारंभिक गिरावट हुई। हालांकि, संक्रमण के बाद 72 घंटे के बाद, बीसीजी लक्स की बायोल्यूमिनेसेंस ने पठार करना शुरू कर दिया, जो लगातार संक्रमण की स्थापना का संकेत है।
इस विशेष संक्रमण प्रणाली में, आरएलयू और सीएलयू का वीवो अनुपात 168 घंटे के समय पाठ्यक्रम पर 4:1 के औसत के साथ 2:1 से 5:1 तक था। इंजेक्शन के दौरान, लार्वा को सुरक्षित करना याद रखें ताकि अधिक पश्चाताप का जोखिम कम हो। आंत के आकस्मिक पंचर से मृत्यु दर बढ़ सकती है।
हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण करके, मेजबान कोशिकाओं के साथ माइकोबैक्टीरिया की शुरूआत की कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा प्रतिलिपि विश्लेषण जीनोमिक स्तर पर बातचीत प्रकट कर सकता है । इस संक्रमण मॉडल का उपयोग विकास में प्रारंभिक चरण में उपन्यास दवा उम्मीदवारों के तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति दे सकता है, जिससे दवा स्क्रीनिंग में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या में काफी कमी आ सकती है।
इस संक्रमण मॉडल के लिए एक सिरिंज के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो सुई-छड़ी चोट से जुड़ी हो सकती है। हम इस तरह के जोखिम को कम करने के लिए हमारे इंजेक्शन तकनीक के उपयोग की सलाह देते हैं।
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