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June 30, 2019
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该协议描述了使用胆小龙作为研究结核病的替代感染模型，减少了研究中使用的哺乳动物模型的数量。与小鼠等传统哺乳动物模型相比，梅隆氏菌是研究结核病的更便宜、合乎道德、更容易获得的模型。进一步优化这一模式将有助于筛选候选抗菌药物的疗效和毒性，并有助于开发急需的结核病新疗法。
梅隆氏菌拥有与哺乳动物相媲美的复杂先天免疫系统。宿主-病原体相互作用的研究可能进一步揭示先天免疫在结核病中的作用。使用胆小龙菌作为感染模型并不限于结核病，在过去十年中已广泛用于其他细菌和真菌病原体。
首先，解冻冷冻的1.2毫升甘油库存的分枝杆 BCG lux，蒙特利尔疫苗株改变与航天飞机质粒pSMT1携带勒克斯AB基因。在标有 250 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中，用 1.2 毫升的 BCG lux 的解冻等同素接种 15 毫升的 Middlebrook 7H9 肉汤。将烧瓶放在密封的生物安全容器中，在37摄氏度的轨道摇床培养箱中孵育，转速为220 rpm，持续72小时。
孵育后，在发光计管、涡流中准备磷酸盐缓冲盐水中的培养物的1：10稀释，然后将发光计管加载到发光计中。将绝对乙醇中的基板1%n-十二甲醛装入喷油器平台，测量生物发光。将生物发光转化为形成菌落的单位，以检查BCG lux文化的生长。
将培养器转移到离心管和离心机，在室温下以2，175倍g进行10分钟，以对细胞进行分粒。将上一液丢弃到具有已知分枝杀菌活性的适当消毒剂中。在50毫升PBS-T中两次清洗细胞颗粒，在2，175次g中离心10分钟，以防止细菌发生。
最后洗涤后，将废物中分液中分液中除掉，并在所需的 PBS-T 体积中重新悬浮分枝杆菌颗粒，将分枝杆菌悬浮液稀释到所需的细胞密度。然后，使用PBS-T在24孔板中准备10倍的连续稀释。将每次稀释的 10 微升板分到中热 7H11 阿加板上重复，以列举银度 CFU 计数。
抵达时，将购买的星幼虫在黑暗中保持18摄氏度，并在购买后一周内使用。根据均匀的奶油颜色、适当的尺寸和重量、高运动性以及在翻过来时具有自我正确的能力，确定并选择健康的幼虫进行实验。使用钝端钳子，仔细计算健康的幼虫到培养皿内衬一层滤纸，并储存在室温在黑暗中，直到使用。
通过将直径 94 毫米的圆形滤纸贴在平坦的凸起表面上，准备喷射平台。将三卷 70% 乙醇吸进 25 微升微西林格中，用三卷无菌 PBS-T 进行灭菌、丢弃和进一步冲洗。然后，重新将准备好的 BCG lux 孵化液重新放入灭菌的微丝中，吸气 10 微升。
使用单独的注射器吸气 PBS-T 进行阴性控制。10次注射后，重新悬浮BCG lux胰岛素，以确保均匀的细胞悬浮。使用钳子拾起一个幼虫并放在注射平台上。
在平台上，将幼虫翻转到其背上，用钳子固定头部和尾部，从而固定。找到最后一个左头，从幼虫的头部向下计数，并小心地插入针尖5至6毫米深，以10至20度角的水平平面。从注射器中注射注射注射。
每次感染后，将受感染的幼虫转移到一个培养皿中，内衬一层滤纸。一个94毫米的培养皿最多可容纳30幼虫。将培养皿存放在37摄氏度的孵化器内，并储存在5%的二氧化碳中。
每24小时监测一次幼虫的生存情况。幼虫被认为是死亡时，他们不能移动回应触摸。使用曼特尔-考克斯测试记录生存并评估统计意义。
每24小时，随机选择5个受感染的幼虫，并使用湿70%乙醇的棉芽拭子轻轻消毒幼虫表面。将幼虫单独放入含有800微升无菌PBS的两毫升回式基质管中。然后，使用均质器以6米/秒的速度使幼虫均质60秒。
将 3，500 次 g 离心管离心 5 秒钟，从盖子上去除均质，并小心地将均质转化为五个无菌发光管。在无菌的1.5毫升反应管中保留100微升的同质质。通过用一毫升 PBS-T 和移液器将 Lysing 基质管洗入相应的发光计管，回收剩余的均质。
涡流发光计管，测量发光仪上同质物的生物发光。然后，使用PBS-T在24孔培养板中准备10倍的连续稀释100微升的均质。移液10微升稀释到每个中热布鲁克7H11加糖板，并使用无菌板扩散器传播。
在37摄氏度下孵育两周。之后，计算殖民地形成单位。确定体内感染后 BCG lux 的 RLU 与 CFU 比率。
在这个实验中，BCG lux剂量依赖性毒性在G.mellonella幼虫中观察到96小时的潜伏期。50%幼虫死亡率所需的致命剂量被确定为7CFU的10倍。对照组注射10微升剂量的PBS-T或那些简单的刺模拟针头损伤，不会影响幼虫健康或导致死亡率上升。
对于感染的幼虫，在感染后48小时内观察到幼虫剂量为7个CFU剂量的BCG lux的功率，从感染后96小时观察到幼虫剂量线的黑色素化。感染1倍10到7CFU剂量的BCG勒克斯的力量导致生物发光在感染后头72小时内的初始下降。然而，感染后72小时，BCG lux的生物发光开始趋于稳定，表明持续感染的建立。
在此特定感染系统中，RLU 和 CFU 的体内比范围从 2：1 到 5：1，在 168 小时时间过程中平均为 4：1。在注射过程中，记得固定幼虫，以便将过度感染的风险降到最低。肠道意外穿刺可能导致死亡率上升。
通过进行组织病理学分析，可以可视化与宿主细胞一起引入分枝杆菌。进一步的转录分析可以揭示基因组层面的相互作用。使用这种感染模型可以允许在开发的早期阶段快速检测新药候选者，大大减少药物筛选中使用的动物数量。
此感染模型需要使用注射器，这可能与针棒损伤有关。我们建议使用我们的注射技术，以尽量减少这种风险。
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最近,肺结核分枝杆菌的可重复、廉价和合乎道德的感染模型被确立为一种可重复、廉价和合乎道德的感染模式。在这里,我们描述和演示了为成功感染生物发光分枝杆菌BCG lux而采取的措施。
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Asai, M., Li, Y., Khara, J. S., Gladstone, C. A., Robertson, B. D., Langford, P. R., Newton, S. M. Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex. J. Vis. Exp. (148), e59703, doi:10.3791/59703 (2019).
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