Immunology and Infection
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मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा तीन डीएनए घावों का परिमाणीकरण और परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर के संपर्क में आने वाले चूहों के ऊतकों में उनके स्तरों का आकलन
Chapters
Summary May 29th, 2019
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हम यहाँ घावों के संवेदनशील और सटीक परिमाणन के लिए विधियां वर्णित करते हैं 8-ऑक्सो-7, 8-डाइहाइड्रो-2'-डिऑक्सीग्वानोसिन (8-ऑक्सोडगुओ), 1,एन6-एथनो-2'-डिऑक्सिडेनोसीन (1,एन6-दाडो) और 1,n2- एथिनो-2'-डीऑक्सीग्वानोसिन (1,N2-DGUO) डीएनए में । इन पद्धतियों को एक/J चूहों के ऊतकों (फेफड़ों, यकृत और गुर्दे) में परिवेशी महीन पार्टिकुलेट मैटर (पीएम२.५) के प्रभाव के आकलन के लिए लागू किया गया था ।
Transcript
यहां प्रस्तुत किए गए तरीके ऑक्सीडेटिव तनाव से प्रेरित डीएनए घावों की मात्रा की अनुमति देते हैं, जो रोगविज्ञानी तंत्रों की समझ में योगदान देते हैं जो बीमारियों की रोकथाम और उपचार के लिए लक्षित हो सकते हैं। चयनशीलता और संवेदनशीलता मुख्य फायदे हैं। जटिल जैविक नमूनों के साथ काम करते समय चयनशीलता एक आवश्यक लाभ है।
एचपीएलसी ने मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री को जैविक मैट्रिस के साथ इस प्रकार के क्वांटिफिकेशन के लिए सोने के मानक के रूप में विकसित किया। ऑक्सीडेटिव तनाव विभिन्न रोगविज्ञानी प्रक्रियाओं के लिए एक आम घटना है। भड़काऊ बीमारियों वाले रोगियों के ऊतकों या मूत्र में एथेनो एडडक्ट्स के बढ़े हुए स्तर का पता चला है।
डीएनए घावों को भी प्रदूषकों के संपर्क में आने से शुरू हुई अंतर्जात घटनाओं के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं । यदि डीएनए घावों में वृद्धि हुई है, जोखिम के स्तर पर हो सकता है कि कैंसर के विकास का खतरा बढ़ जाता है, उदाहरण के लिए । घावों को डीएनए में किसी भी सेलुलर प्रणाली से और वैकल्पिक रूप से मूत्र, प्लाज्मा, लार संस्कृति माध्यम में नमूना तैयारी में अनुकूलन के साथ निर्धारित किया जा सकता है।
शुरू करने के लिए, एक स्केलपेल के साथ ऊतक के एक टुकड़े को काटने के लिए एक आधार के रूप में बर्फ पर रखी एक संस्कृति प्लेट का उपयोग करें। तत्काल उपयोग के लिए प्रत्येक 50-मिलीलीटर कैप्ड ट्यूब में ऊतक के एक ग्राम का वजन करें। माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने से पहले बचे हुए टिश्यू को सूखी बर्फ पर रखें।
प्रत्येक ट्यूब में, 0.5-मिलीमोलर डेफरोक्सामाइन युक्त वाणिज्यिक सेल लाइसिस समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और बर्फ पर रखें। टिश्यू होमोजेनाइजर को कम स्पीड में सेट करें, करीब 60 से 90 आरपीएम। ऊतकों के टुकड़ों के बिना समाधान होने तक कुछ मिनटों तक बर्फ पर ऊतकों को समरूप करें।
फिर, प्रत्येक समरूप नमूने में प्रोटीन के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। उलटा द्वारा ट्यूबों हिलाएं, और उन्हें रात भर कमरे के तापमान पर रखें। सुबह में, रिबोन्यूलीज ए सॉल्यूशन के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें, उलटा करके हिलाएं, और ट्यूबों को दो घंटे तक कमरे के तापमान पर रखें।
वाणिज्यिक प्रोटीन वर्षा समाधान के पांच मिलीलीटर जोड़ें, भंवर सख्ती से, और 2, 000 बार जी, चार डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र, 10 मिनट के लिए । सुपरनेटेंट को 50-मिलीलीटर कैप्ड ट्यूबों में स्थानांतरित करें जिसमें 10 मिलीलीटर ठंड आइसोप्रोपैनॉल होता है। उपजी डीएनए के अवलोकन तक ट्यूबों को धीरे-धीरे कई बार उलटा करें।
उपजी डीएनए को इकट्ठा करने के लिए अंत में बंद एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। एकत्र डीएनए को 10-मिलीमोलर ट्रिस बफर और पीएच सात पर एक मिलीमोलर डिफेरोक्सामाइन के चार मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें। डीएनए पूरी तरह से ट्यूबों में भंग होने के बाद, प्रत्येक ट्यूब में 4% आइसोअमिल अल्कोहल युक्त क्लोरोफॉर्म समाधान के चार मिलीलीटर जोड़ें।
समरूपता के लिए ट्यूबों को 10 बार उलटा करें, 2, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र, चार डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए, और ऊपरी चरणों को नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें। ऊपरी चरण के वॉश को दो बार और क्लोरोफॉर्म सॉल्यूशन के साथ दोहराएं। फिर, डीएनए को उपजी करने के लिए पूर्ण इथेनॉल के आठ मिलीलीटर और पांच-मोलर सोडियम क्लोराइड समाधान के 0.4 मिलीलीटर जोड़ें।
फिर, उपजी डीएनए इकट्ठा करें, और इसे 70% इथेनॉल के तीन मिलीलीटर में स्थानांतरित करें। एक बार 70% इथेनॉल के साथ धोने दोहराएं। इथेनॉल समाधान को सावधानी के साथ त्यागें, और अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए शोषक कागज पर उपजी डीएनए युक्त ट्यूबों को उलट दें।
पांडुलिपि के अनुसार 15N5 आइसोटोपिक मानक के साथ डीएनए हाइड्रोलिटिस नमूने तैयार करने के बाद, एन 6-एथेनो-डिऑक्सियाडेनोसाइन और 15एन5 आइसोटोपिक मानक 1, एन 2-एथेनो-डिऑक्सीगुआनोसिन पांडुलिपि के अनुसार, एचपीएलसी-यूवी द्वारा सामान्य डीऑक्सीनियोसाइड्स की मात्रा के लिए प्रत्येक नमूने के 10 माइक्रोलीटर को ट्यूबों में स्थानांतरित करें। अवशिष्ट मात्रा को ठोस चरण निष्कर्षण के अधीन करें। एचपीएलसी करने के लिए, पहले 0.1% फोर्मिक एसिड और मेथनॉल के ढाल के साथ C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस से जुड़े C18 कॉलम को एल्यूट करें।
शून्य से 18% मेथनॉल के साथ शून्य से 25 मिनट तक चलाने के लिए ढाल कार्यक्रम स्थापित करें, 25 से 27 मिनट तक 18 से 0% मेथनॉल के साथ, फिर 27 से 37 मिनट तक 0% मेथनॉल के साथ एक मिलीलीटर प्रति मिनट और 30 डिग्री सेल्सियस की प्रवाह दर पर। उसके बाद, सामान्य डिऑक्सी न्यूक्लियोकोसाइड्स क्वांटिफिकेशन के लिए आरक्षित प्रत्येक नमूने के लिए दो और छह माइक्रोलीटर के बीच एक मात्रा इंजेक्ट करें। डेक्सिगुआनोसिन और डिऑक्सियाडेनोसाइन चोटियों के एकीकरण के लिए 260 नैनोमीटर पर डैड डिटेक्टर सेट करें।
1, N6-etheno-deoxyadenosine और 1, N2-etheno-deoxyguanosine के विश्लेषण के लिए ठोस चरण निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए, पहले एक मिलीलीटर की मात्रा में समाधान की एक श्रृंखला के साथ कारतूस लोड । संग्रहण के लिए 100% मेथनॉल, डिवोनाइज्ड पानी, हाइड्रोलिज्ड डीएनए नमूना, डिवोनाइज्ड पानी, 10% मेथनॉल, 15% मेथनॉल और अंत में 100% मेथनॉल जोड़ें। इसके बाद पांडुलिपि के अनुसार आगे बढ़ें।
डीएनए हाइड्रोलिसिस नमूने तैयार करने के बाद 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन के 15एन5 आइसोटोपिक मानक, एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस सिस्टम में विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूने के 80 माइक्रोलीटर को शीशियों में स्थानांतरित करें। एचपीएलसी-यूवी पर डीऑक्सीगुआनोसिन के क्वांटिफिकेशन के लिए शेष 20 माइक्रोलीटर आरक्षित करें, जैसा कि पहले किया गया था। एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस पर 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन के विश्लेषण के लिए, C18 कॉलम ए को एक C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस के साथ मिलकर १५० माइक्रोलिटर्स प्रति मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस की प्रवाह दर पर सॉल्वेंट ए और बी के ढाल के साथ ।
पहले 25 मिनट के दौरान सॉल्वेंट बी के जीरो से 15% के साथ बाइनरी पंप चलाएं, 25 से 28 मिनट तक 15 से 80%, 28 से 31 मिनट तक 80%सॉल्वेंट बी, 31 से 33 मिनट तक 80 से 0%, और 33 से 46 मिनट तक सॉल्वेंट बी का 0%। कॉलम के पहले 16 मिनट को बर्बाद करने के लिए एक eluent निर्देशित करें। 150 माइक्रोलीटर प्रति मिनट की प्रवाह दर पर 0.1% फोर्मिक एसिड युक्त पानी में 15% मेथनॉल के समाधान के साथ आइसोक्रेटिक पंप द्वारा स्थिति कॉलम बी।
छह मिनट के बाद, क्रोमाटोग्राम की जांच करें ताकि कॉलम ए से 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन मानक elutes को सुनिश्चित किया जा सके। 16 से 32 मिनट के अंतराल के दौरान, वाल्व को कॉलम ए और कॉलम बी के बीच कनेक्शन की अनुमति देने की स्थिति में स्विच करें। 32 मिनट में वाल्व को बंद करने के लिए दूसरे कॉलम से 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन को एल्यूट करने के लिए और एक तेज क्रोमेट पीकोग्राफिक प्राप्त करें। 1, N6-etheno-deoxyadenosine और 1, N2-etheno-deoxyguanosine के विश्लेषण के लिए, एक C18 कॉलम के साथ एक C18 सुरक्षा गार्ड कारतूस के साथ एक सी 18 सुरक्षा गार्ड कारतूस के साथ १३० माइक्रोलीटर प्रति मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस की प्रवाह दर पर एक सी 18 सुरक्षा गार्ड कारतूस के साथ elute । पहले 10 मिनट के लिए सॉल्वेंट बी के 0% के साथ बाइनरी पंप चलाएं, 10 से 39 मिनट तक सॉल्वेंट बी का जीरो टू 20 फीसदी, 39 से 41 मिनट तक सॉल्वेंट बी का 20 से 75 फीसदी, 41 से 46 मिनट तक 75 फीसदी, सॉल्वेंट बी का 46 से 47 मिनट तक का 75 से 0 फीसदी और 47 से 60 मिनट तक सॉल्वेंट बी का 0 प्रतिशत।
स्विचिंग वाल्व का उपयोग करने के लिए बेकार करने के लिए eluent के पहले ३५ मिनट और ईएसआई स्रोत के लिए ३५ से ४२ मिनट अंश प्रत्यक्ष । सुनिश्चित करें कि एडक्टेड मानक निर्धारित अंतराल में कॉलम से एल्यूट करते हैं। 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन की चोटियों को एकीकृत करें 15एन5 आइसोटोपिक मानक 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 15N5 आइसोटोपिक मानक 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, और 15N5 के आइसोटोपिक मानक 1, N2-etheno-deoxyguanosine एचपी-ESI-MS/MS विश्लेषण से विश्लेषण करता है ।
अंशांकन घटता और नमूनों के लिए क्षेत्र अनुपात की गणना करें। अंशांकन घटता स्थापित करें, और प्रत्येक इंजेक्शन नमूने में घावों की मात्रा की गणना करें। एचपीएलसी-यूवी विश्लेषण से डेऑक्सीगुआनोसिन और डिऑक्सियाडेनोसाइन की चोटियों को एकीकृत करें।
अंशांकन घटता स्थापित करने के लिए क्षेत्रों का उपयोग करें, और प्रत्येक इंजेक्शन नमूने में जानवरों में deoxyguanosine और deoxydenosine की मात्रा की गणना करें। डिऑक्सीगुआनोसिन पर 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन के लिए मोलर अंशों की गणना करें, 1, एन 6-एथेनो-डीऑक्सियाडेनोसाइन पर डीऑक्सियाडेनोसाइन, और 1, एन 2-एथेनो-डीऑक्सीगुआनोसिन पर डीऑक्सीगुआनोसिन, जो प्रति एक मिलियन सामान्य डीऑक्सीगुआनोसिन या डिऑक्सिओसिन की संख्या देते हैं। एचपीएलसी-यूवी द्वारा प्राप्त शुद्ध डीएनए का एक प्रतिनिधि क्रोमाटोग्राम डीएनए शुद्धता का प्रदर्शन करते हुए आरएनए रिबोन्यूक्लियोसाइड्स से मुक्त चार सामान्य डीऑक्सी न्यूक्लिकोसाइड्स की उपस्थिति दिखाता है।
8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन, 1, एन6-एथेनो-डिऑक्सिडेनोसिन और 1, चूहों के ऊतक डीएनए नमूनों में N2-etheno-deoxyguanosine के एचपीएलसी-ईएसआई-एमएस/एमएस से प्रतिनिधि क्रोमाटोग्राम दिखाए जाते हैं । यूवी डिटेक्शन के साथ प्राप्त क्रोमाटोग्राम पहले कॉलम से लगभग 10 मिनट तक चार सामान्य डीऑक्सी न्यूक्लियोसाइड्स को दिखाता है, जिसमें 8-ऑक्सो-डिऑक्सीगुआनोसिन से अच्छा अलगाव होता है, जो अवांछित हस्तक्षेपों को नष्ट करता है। सटीक मात्रा के लिए याद रखने के लिए एक महत्वपूर्ण बात अंशांकन घटता और नमूनों में इंजेक्शन की मात्रा में आंतरिक मानकों की हमेशा एक ही मात्रा है।
यहां प्रस्तुत किए गए तरीकों को अन्य संशोधित डिऑक्सीन्यूक्लियोसाइड्स के परिमाणीकरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। संशोधित डिऑक्सी न्यूक्लियोसिनेस्टोसाइड्स के बैंड का विस्तार अंतर्निहित रोगविज्ञानी तंत्र की बेहतर समझ की अनुमति देता है। हम विभिन्न स्थितियों में ऑक्सीडेटिव क्षति की भूमिका की जांच कर सकते हैं जैसे कि ज़ेनोबायोटिक्स, मधुमेह और सेल घातक परिवर्तन के संपर्क में, इसलिए निवारक और उपचार रणनीतियों के विकास में सहायता करते हैं।
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