Journal
/
/
Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films
JoVE Journal
Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Developmental Biology
Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

Vorming van menselijke parodontitis ligament Cell Sferoïden op Chitosan films

5,268 Views

04:14 min

June 19, 2019

DOI:

04:14 min
June 19, 2019

2 Views
, , , , , ,

Transcript

Automatically generated

Dit is een gedetailleerd protocol van het kweken van parodontale ligament cel sferoïden door chitosan films. Vergeleken met het conventionele kweeksysteem produceert het sferoïde kweeksysteem parodontale ligamentcellen met verhoogde zelfvernieuwing en osteogene differentiatievaardigheden. Om te beginnen, bereid 1%gewicht-tot-volume chitosan oplossing zoals aangegeven in het manuscript.

Voeg 0,5 milliliter chitosan oplossing in elke put van een 24-well weefsel cultuur polystyreen plaat. Droog de plaat in een oven op 60 graden Celsius gedurende 24 uur om chitosan films te vormen. Om de chitosan films te neutraliseren, voeg 0,5 milliliter van 0,5 normale natriumhydroxide toe aan elke put van de 24-put plaat en incubeer bij kamertemperatuur gedurende twee uur.

Was vervolgens de chitosanfilms drie keer met dubbel gedestilleerd water. Steriliseer de chitosan-gecoate 24-well plaat in 70% alcohol ‘s nachts bij kamertemperatuur. Spoel de plaat drie keer met PBS en laat hem ‘s nachts onder ultraviolet licht achter.

Voorafgaand aan cel zaaien, pre-warme proliferatie medium, PBS oplossing, en trypsine EDTA oplossing tot 37 graden Celsius. Gooi de supernatant uit de celkweekkolf en was de samenvloeiende parodontale ligament, of PDL-cellen, met 10 milliliter PBS. Gooi de PBS en voeg een milliliter trypsine EDTA-oplossing toe aan de kolf.

Incubeer de kolf op 37 graden Celsius gedurende drie minuten en voeg vervolgens drie milliliter proliferatiemedium toe om de trypsinevertering te beëindigen. Breng de celsuspensie over op een conische buis van 15 milliliter en vercenter het vijf minuten op 300 keer g. Gooi de supernatant weg en schort de cellen opnieuw op in 500 microliter proliferatiemedium.

Tel de cellen met een hemocytometer en zaad ze op de plaat op vijf, 10, 30 en 60 duizend cellen per vierkante centimeter. Kweek de PDL-cellen in een couveuse bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide en bevochtelde lucht, waardoor het kweekmedium twee keer per week verandert. Observeer celmorfologie dagelijks gedurende vijf dagen via een omgekeerde fase contrastmicroscoop.

Levensvatbare PDL-celferoïden worden met succes gevormd met behulp van dit protocol. Sferoïden worden zelden waargenomen voor de lagere zaaidichtheid op dag één en drie. Maar bij de twee hogere dichtheden zijn vanaf dag één verschillende maten sferoïden aanwezig.

De optimale zaaidichtheid is 30 duizend cellen per vierkante centimeter omdat het resulteert in homogene sferoïden. Na vijf dagen van cultuur, grotere sferoïden worden waargenomen voor alle zaaien dichtheden. Een levensvatbaarheidstest toont aan dat de meerderheid van de PDL-cellen in leven zijn op dag één, drie en zes, maar het aantal dode cellen neemt toe op dag zes.

Een beperking van dit protocol is de verminderde proliferatie van cellen na sferoïde vorming. Dus verdere studies ter bevordering van de proliferatie van cellen na sferoïde vorming zijn vereist.

Summary

Automatically generated

Hier presenteren we protocollen van kweken menselijke parodontitis ligament (PDL) cel sferoïden door Chitosan films. De cultuur van drie-dimensionale (3D) cellulaire sferoïden biedt een alternatief voor conventionele weefselcultuur polystyreen (TCPS) cultuursysteem.

Read Article