Immunology and Infection
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Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)
Chapters
Summary January 31st, 2020
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Questo protocollo utilizza peptidi misti G6PI per costruire modelli di artrite reumatoide che sono più vicini a quello dell'artrite reumatoide umana in CD4- cellule T e citochine. Cellule T killer naturali ad alta purezza (principalmente iNKT2) con fenotipi e funzioni specifiche sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro per l'immunoterapia adottiva.
Transcript
Il nostro protocollo descrive un metodo per creare un modello RA. Il suo tasso di successo è superiore al 93% e la sua patogenesi dipende dalle cellule T, dalle cellule B e dall'immunità innata, che consente ai ricercatori di studiare meglio la patogenesi di RA da una prospettiva immunitaria globale. Quindi usiamo cellule INKT con effetti immunomodulatori per il loro trattamento.
Le cellule INKT hanno un buon effetto sul trattamento con introduzione in vivo che forniscono supporto di base ai dati per l'applicazione clinica delle cellule INKT ed esplodono davvero il valore di applicazione clinica delle cellule INKT. Il più grande vantaggio di questa tecnologia è che è semplice da usare e facile da copiare. A dimostrare la procedura saranno Chen Shengde, Gao Xiang e Zhang Jingnan, studente laureato del mio laboratorio.
Per iniziare, pesare da 1,75 milligrammi di frammenti da HGPI325 a 339 e da HGPI469 a 483 e scioglierli in 5,25 millilitri di acqua tripla distillata da 4 gradi Celsius. Sciogliere l'adiuvante di Freund completo in un bagno d'acqua di 50 gradi Celsius. Disegnare 5,25 millilitri in un altro tubo di centrifuga da 10 millilitri e raffreddarlo per l'uso.
Mettere la miscela della soluzione HG6PI e della soluzione Adjuvant di Complete Freund in un'unità di emulsione artificiale con due siringhe di vetro, collegate. In un bagno di ghiaccio, spingere la siringa a una velocità e una frequenza costanti da dieci a venti volte al minuto per emulsionare completamente la soluzione peptidica della miscela e completare la soluzione adiuvante di Freund. Quindi, tenere le goccioline di emulsione nell'acqua per dieci minuti.
Successivamente, iniettare 150 microlitri degli HG6PI emulsionati nella radice della coda del mouse per via sottocutanea. Immediatamente e dopo 48 ore, iniettare 200 milligrammi di tossina pertosse nel topo per via intraperineale. Ora, iniettare il normale topo DBA1 per via intraperineale senza il gausser al dosaggio di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo.
Tre giorni dopo la modellazione, dopo l'anestesia, isolare la milza del mouse. Preparare una sospensione a cella singola tagliando e macinando la milza in un setaccio a rete 200. Lavare le sospensioni cellulari con PBS.
Centrifugare a 200 volte g per cinque minuti e scartare il supernatante. Sospendere di nuovo le cellule con un millilitro di soluzione di tessuto sanguigno intero. Aggiungere tre millilitri di mezzo di separazione dei linfociti di topo.
E poi centrifugare le cellule per 20 minuti a 300 volte g a temperatura ambiente. Per purificare le cellule INKT, resuspend 10 alla settima cellule con 100 microlitri di quattro gradi Celsius PBS, aggiungere 10 microlitri di tetramero CD1 caricato da alpha gausser PE e incubarli a 4 gradi Celsius per quindici minuti al buio. Lavare le cellule due volte con PBS e riprenotarle in 80 microlitri di PBS.
Aggiungere 20 microlitri di microperline anti-PE e incubarli a quattro gradi Celsius per venti minuti al buio. Lavarli due volte con PBS e rimorsi le cellule con 500 microlitri di PBS. Posizionare la colonna di smistamento nel campo magnetico dello smistatore MACS e risciacquare con 500 microlitri di PBS.
Aggiungere la sospensione cellulare preparata alla colonna di ordinamento, raccogliere il flusso e risciacquare tre volte con il buffer PBS. Rimuovere il campo magnetico e aggiungere un millilitro di buffer PBS alla colonna di ordinamento. Spingere rapidamente lo stantuffo a una pressione costante per guidare le celle etichettate nel tubo di raccolta.
E ottenere le cellule INKT purificate. Contare con un contatore di celle automatico. Per identificare il fenotipo della cellula INKT, in primo luogo, prendere una per dieci alla sesta cella dalle cellule INKT purificate e ripreposirle in 50 microlitri di PBS.
Aggiungere 0,5 microlitri di tetramero ALFA GAUSSER PE CD1 o 10 microlitri di FITC TCR beta nel singolo tubo di controllo positivo. Aggiungere 0,5 microlitri di tetramero ALFA GAUSSER PE CD1, Aggiungere 10 microlitri di FITC TCR beta nel tubo campione. Incubarli a quattro gradi Celsius per trenta minuti al buio.
Successivamente, lavare le cellule in PBS e quindi centrifugare a 200 volte g per cinque minuti. Scartare il supernatante e aggiungere un millilitro della soluzione di lavoro di permeabilità alla fissazione FoxP3. E incubare le cellule per 45 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Quindi, aggiungere un millilitro di 1 soluzione di lavoro permeabilizzazione e centrifugare le cellule a 500 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti. Scartare il supernatante. Aggiungere un microlitro di AlexaFluor 647 mouse anti-PLZF e un microlitro di PerCP Cy5.5 mouse anti-Tbet e incubare per trenta minuti a temperatura ambiente al buio.
Successivamente, aggiungere due microlitri di soluzione di lavoro tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 200 volte g per cinque minuti per la pulizia. Scartare il supernatante. Rimospendare le cellule in 500 microlitri di PBS e misurare per citometria del flusso.
In questo studio, rispetto al gruppo di controllo, le dita dei piedi del gruppo di modelli RA hanno iniziato a mostrare gonfiore rosso dopo la modellazione con aggravamento graduale. A 14 giorni, il gonfiore rosso nell'articolazione della caviglia ha raggiunto il picco seguito da un graduale sollievo. I risultati patologici mostrano che il grado di infiltrazione delle cellule infiammatorie nel tessuto sinoviale della caviglia dei topi modello RA era diverso in diversi stadi.
L'infiammazione di picco si è verificata il giorno 14 dopo la modellazione. Nel gruppo di modelli RA, i livelli sieri delle citochine pro-infiammatorie sono aumentati significativamente 11 giorni e 14 giorni dopo la modellazione. Mentre le citochine antinfiammatorie sono diminuite significativamente.
Questa cifra mostra che il tasso di INKT2 nei topi normali era di circa il cinque per cento. Il tasso di INK2 era di circa l'82% dopo l'induzione in vivo. Il tasso di INK2 è stato superiore al 92% dopo la purificazione MACS.
Qui mostriamo un metodo per emulsionare il polipeptide maggiore che vediamo in RA. Le goccioline emulsionate vengono conservate in acqua per 10 minuti. I risultati si disperdono. Questo protocollo è un nuovo componente aggiuntivo per il trattamento delle cellule NKT speciali allevati ra.
Che può essere applicato verso l'immunoterapia cellulare o altre malattie autoimmuni e tumori. Questo modello può stimolare la proliferazione complessiva delle cellule T CD4 e dei deficit delle cellule NKT nei pazienti con RA, che pone le basi per uno studio approfondito delle vie immunitarie RA. In questo protocollo, la tossina pertosse viene iniettata per via interperitoneale durante la modellazione.
Si prega di indossare abiti sperimentali e guanti monouso. E portare tutti gli standard di funzionamento in modo da prevenire la pugnalata ferita un'infezione.
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