Biochemistry
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NEMO IKK绑定域的生产、结晶和结构确定
Chapters
Summary December 28th, 2019
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我们描述了通过X射线晶体学测定NEMOIKK结合域的结构确定方案。这些方法包括蛋白质表达、纯化和表征，以及成功优化晶体和确定无结合形式蛋白质的结构的策略。
Transcript
该协议有助于成功确定 NEMO 的 IKK 绑定域，其无边界形式。及其生产和结晶的细节。该协议，利用这种稳定，通过盘绕线圈适配器对NEMO的 IKK 绑定域片段的本机确认，从而促进结晶和结构确定。
作为靶向，NEMO的结构生物学为治疗炎症和自身免疫性疾病和癌症的NEMO抑制剂的发展提供了重要优势。该协议可以扩展到NEMO复合物的结构测定，与肽或小分子抑制剂的药物发现或优化。在蛋白质生产阶段，蛋白质的再折叠和浓度对于获得纯NEMO二丁剂至关重要。
限制聚合并确保结晶条件下的溶解性。演示程序将是塔玛和艾米，研究生在我们的实验室。首先添加20毫升的很棒的肉汤溶液。
和20微升100毫克每毫升库存溶液的安西林。到 125 毫升埃伦迈尔烧瓶。其次是BL21DE3称能力细胞的一些微升细胞甘油储存，从80摄氏度的储存。
使用矢量转换。在一夜之间摇动启动培养体后，以每分钟37摄氏度和220次旋转的速度，将细胞稀释为0.1和250毫升的OD600和250毫升的特好肉汤。将安西林加入每毫升100微克的最终浓度。
当培养物的OD600达到0.8比1时，将IPTG添加到培养物中，加入500微摩尔浓度。在37摄氏度下生长细胞4小时，直到OD600达到6到10。在孵化结束时，通过离心沉淀细胞。
并在40毫升的解液缓冲液中重新悬浮颗粒。将重新悬浮的细胞分成两个20至25毫升的等分。使用法国印刷机在寒冷的房间里对每平方英寸的压力施加大约25，000磅的压力，每分两位到三倍。
接下来，将尿素加入细胞落酸，最终浓度为八摩尔。在摇摇平台上孵育细胞溶液2至16小时，在室温下。第二天早上，将落酸转移到超离心管，每个管至少满四分之三。
和乌尔塔离心机的莱酸盐，45分钟。将超自然剂放入50毫升锥形管中。将尿素孵育的中分液加载到 IMAC 柱上，每分钟三毫升。
当所有上流板都运行到列中时，以每分钟 3 毫升的速度用绑定缓冲区将列洗涤 10 列卷。并在 12 列体积梯度上对 NEMO-EEAA 蛋白进行 10 至 500 毫摩尔的梯度洗脱。收集一毫升的分水，放入一个分数收集板。
SDS页面分析后，提取含有纯靶蛋白的分数，根据标准方案通过布拉德福德测定测量蛋白质浓度。选择含有蛋白质的逃避分数。要切开 HIS6 标签并从样品中去除多余的 imidazole，请将 TEV 蛋白酶（重量比为 1 至 10）添加到目标蛋白样品中。
将样品在四升20毫摩尔三叶草中隔夜膨胀。150毫摩尔氯化钠和两毫摩尔DTT溶液。第二天早上，将 TEV 切割的 NEMO-EEAA 样品加载到第二个 IMAC 柱上，每分钟一毫升。
在 96 碗分数收集板中收集流在一毫升分数中。用五卷 20 毫摩尔三升、150 毫摩尔氯化钠和 10 毫摩尔 imidazole 溶液清洗柱，每分钟一毫升。上次洗涤后，将 TEV 和未洁的 HIS6 NEMO-EEAA，用三列卷 20 毫摩尔三叶、150 毫摩尔氯化钠、500 毫摩尔伊米达佐尔和两毫摩尔 DTT 溶液，放入 50 毫升烧瓶中。
将流拉过馏分，包含切割的NEMO-EEAA构造，用搅拌细胞集中器将样品浓缩到5毫升。过夜透析后，将样品的5毫升加载到16毫米60厘米大小的排除色谱柱上。根据需要根据样品体积重复。
每分钟一毫升，在两毫摩尔三叶草，100毫摩尔氯化钠和两毫摩尔滴滴涕溶液。拉出与一毛钱 NEMO-EEAA 对应的分数后，将样品浓缩在搅拌细胞集中器中，分子量切断膜三千吨，最终浓度为 113 微摩尔。然后，将蛋白质储存在摄氏四度，长达一个月。
对于稀疏基质筛选，在两滴室结晶板的 96 孔中，每个孔中加入 60 微升稀疏基质溶液。用于坐落蒸汽扩散。并将蛋白质溶液添加到机器人滴液中。
接下来，使用机器人滴液器，以每毫升1.65毫克的速度分配100纳米的蛋白质溶液，以一比一的比例分配储液溶液，最终体积为200纳米升。并添加66纳米升的蛋白质溶液与134纳米升的储层溶液，最终体积200纳米升滴2。然后，立即用三英寸宽的密封胶带密封板。
然后，将托盘存放在结晶成像器存储中，温度为 20 摄氏度。检查自动收集的图像，是否存在晶体，从存储板后两天开始。对于种子库存的生成，从种子生成套件中，将含有感兴趣的晶体的整个滴转移到 50 微升的结晶条件溶液中。
和漩涡种子库存，20秒的脉动和10秒的休息，三分钟。然后，以1到10个增量连续稀释种子库存，至1至10，000。并在四摄氏度下储存稀释液，直到进一步使用。
一到两天前装运到同步加速器，从井顶部切割胶带，与感兴趣的晶体。并添加0.5微升的结晶溶液，含有12%一、二丙烷DIO低温保护剂，直接到井中。用低温循环轻轻将晶体分离。
将晶体从井中循环，将含有低温环的晶体存放在浸于液氮中的冰球中，直到装运进行X射线衍射。接收 X 射线衍射数据后，处理 STAR 和 ISO 服务器中的缩放强度。使用 X 射线晶体学索引切断均值，数据衍射极限表面为 1.2。
并加载到凤凰城。要确定结构，请使用GCN4的X射线结构作为分子替换的搜索模型，使用凤凰城的MRage。4DMD 结构，将定义为一个整体。
MRage 解决方案将成功地构建到结构部分，对应于 NEMO-EEAA 的端端子线圈线圈适配器。搜索模型，用于两个链条的暗淡。在第一个IMAC柱纯化之前，过度表达的蛋白质出现在一个带子上，大约14千吨分子量标记。
并在第一次洗脱后，分别以14公斤和28千吨显示单体带和二丁带。TEV 裂解实际上是完整的，在洗脱之后，通过第二个 IMAC 列。几乎完全作为一个暗淡，在预期的分子量。
大小排除色谱，显示单个峰值，从 60 到 65 毫升之间，谁是对暗光的反应。精细筛选产生的晶体可用于生产用于生产NEMO-EEAA晶体的种子库存，用于数据收集。在这里，显示了具有代表性的NEMO-EEAA晶体衍射剖面图。
对NEMO-EEAA蛋白的结构分析揭示了一个同质的不规则平行盘绕，长度约为175个焦虑。常规盘绕区域，包括理想的线圈线圈适配器序列，在终点。和 NEMO 正确序列的前两个七氯图。
一个常规的线圈，也出现在C术语。从 NEMO 残留物 97 开始，包括 C 端子的理想线圈线圈适配器。IKK beta 绑定结构，显示更开放的线圈确认，以适应配体。
与更大的间距间距 1 到 2.2 焦虑在这个区域。NEMO中配体的结构，通过计算方法为抑制剂的设计提供了一个新的目标。和与小分子库结合口袋的视觉筛选。
我们现在有一条在具有小分子配体的复杂中实现工程性NEMO构造结晶的路径。帮助开发和优化新型抑制剂。
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