Biochemistry
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एनईएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण
Chapters
Summary December 28th, 2019
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हम एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी द्वारा एनओएमओ के आईकेके-बाइंडिंग डोमेन के संरचना निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। तरीकों में प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन के साथ-साथ सफल क्रिस्टल अनुकूलन और प्रोटीन के संरचना निर्धारण के लिए रणनीतियां शामिल हैं।
Transcript
यह प्रोटोकॉल अपने अनबाउंड रूप में निमो के IKK बाध्यकारी डोमेन के सफल संरचना निर्धारण की सुविधा प्रदान करता है। और इसके उत्पादन और क्रिस्टलीकरण का विवरण । प्रोटोकॉल, कुंडलित-कुंडल एडाप्टर के माध्यम से, निमो के IKK बाध्यकारी डोमेन टुकड़े की मूल पुष्टि के इस स्थिरीकरण का लाभ उठाता है, जो क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण की सुविधा प्रदान करता है।
निमो का संरचनात्मक जीव विज्ञान, एक लक्ष्य के रूप में, भड़काऊ और ऑटोइम्यून रोगों और कैंसर के उपचार के लिए निमो अवरोधकों के विकास में एक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल को दवा खोज या अनुकूलन के लिए पेप्टाइड या छोटे अणु अवरोधकों के साथ निमो परिसरों के संरचना निर्धारण तक बढ़ाया जा सकता है। प्रोटीन उत्पादन चरण के दौरान प्रोटीन रिवलनिंग और एकाग्रता, शुद्ध निमो डिमर प्राप्त करने के लिए मौलिक हैं।
एकत्रीकरण को सीमित करना और क्रिस्टलीकरण की स्थिति के तहत घुलनशीलता सुनिश्चित करना। प्रक्रियाओं का प्रदर्शन तमाड़ और एमी, हमारी प्रयोगशाला में स्नातक छात्रों होगा । भयानक शोरबा समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़कर शुरू करें।
और एम्पीसिलिन के मिलीलीटर स्टॉक समाधान प्रति 100 मिलीग्राम के 20 माइक्रोलीटर। एक १२५ मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क करने के लिए । इसके बाद सेल ग्लिसरोल स्टॉक के कुछ माइक्रोलीटर, BL21DE3 सक्षम कोशिकाओं के 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से।
वेक्टर के साथ बदल दिया। स्टार्टर संस्कृति रातोंरात मिलाते हुए, ३७ डिग्री सेल्सियस और प्रति मिनट २२० घूर्णन पर, ०.१ और भयानक शोरबा के २५० मिलीलीटर के एक OD600 के लिए कोशिकाओं को पतला । और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में एम्पिसिलिन जोड़ें।
जब संस्कृति का OD600 0.8 से 1 तक पहुंचता है, तो संस्कृति में आईपीटीजी जोड़ें, 500 माइक्रोमोलर एकाग्रता में। और चार घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित, ३७ डिग्री सेल्सियस पर, जब तक OD600 छह से 10 तक पहुंचता है । इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को तलछट।
और लाइसिस बफर के 40 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें। पुनः निलंबित कोशिकाओं को दो 20 से 25 मिलीलीटर एलिकोट में विभाजित करें। और एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं के लिए दबाव के प्रति वर्ग इंच लगभग 25, 000 पाउंड लागू होते हैं, दो से तीन बार aliquot प्रति, एक ठंडे कमरे में ।
इसके बाद, आठ मोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए सेल lysates में यूरिया जोड़ें। और कमरे के तापमान पर दो से 16 घंटे के लिए एक कमाल के मंच पर सेल समाधान इनक्यूबेट । अगली सुबह, lysates को अल्ट्रा-सेंट्रलाइज ट्यूबों में स्थानांतरित करें, कम से कम तीन तिमाहियों में, प्रति ट्यूब।
और उलर्टा सेंट्रलाइज lysates, ४५ मिनट के लिए । सुपरनेटेंट्स को 50 मिलीलीटर शंकुदाता में डिसेंट करें। और यूरिया इनक्यूबेटेड सुपरनेट को आईमैक कॉलम पर तीन मिलीलीटर प्रति मिनट पर लोड करें।
जब सभी सुपरनैटर कॉलम के माध्यम से चला है, तो 10 कॉलम वॉल्यूम के लिए कॉलम को धोएं, बाध्यकारी बफर के साथ, प्रति मिनट तीन मिलीलीटर पर। और 12 कॉलम वॉल्यूम रेडिएंट पर 10 से 500 मिलीमोलर इमिडाजोल से निमो-ईईएए प्रोटीन का ढाल संयुव करते हैं। एलुएट के एक मिलीलीटर एलिकोट्स को एक अंश संग्रह प्लेट में इकट्ठा करना।
एसडीएस पेज विश्लेषण के बाद, शुद्ध लक्ष्य प्रोटीन युक्त अंशों को खींचें और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापें। प्रोटीन युक्त, नहीं मिल पाई अंशों का चयन करें। HIS6 टैग को क्लीव करने के लिए और नमूने से अतिरिक्त इमिडाजोल को हटाने के लिए, टीईवी प्रोटीज को एक से 10 वजन अनुपात में, टीईवी क्लीव्ड प्रोटीन के लक्ष्य प्रोटीन नमूने में जोड़ें।
और 20 मिलीमोलर ट्रिस के चार लीटर में रात भर नमूना फैलाएं। 150 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड और दो मिलीमोलर डीटीटी सॉल्यूशन। अगली सुबह, एक दूसरे आईमैक कॉलम पर, प्रति मिनट एक मिलीलीटर पर TEV cleaved NEMO-EEAA नमूना लोड करें।
एक मिलीलीटर अंशों में प्रवाह का संग्रह, एक 96 कटोरा अंश संग्रह प्लेट में। कॉलम को एक मिलीलीटर प्रति मिनट पर 20 मिलीमोलर ट्रिस, 150 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड और 10 मिलीमोलर इमिडाजोल समाधान के पांच वॉल्यूम के साथ धोएं। अंतिम धोने के बाद, तेव को एल्यूट किया और 20 मिलीमोलर ट्रिज़, 150 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड, 500 मिलीमोलर इमिडाजोल और दो मिलीमोलर डीटीटी समाधान के तीन कॉलम वॉल्यूम के साथ 50 मिलीलीटर फ्लास्क में, HIS6 निमो-ईईएए को अलग किया।
अंशों के माध्यम से प्रवाह खींचो, क्लीव्ड निमो-EEAA निर्माण युक्त और एक उभारा सेल ध्यान के साथ नमूना ध्यान केंद्रित, पांच मिलीलीटर के लिए । प्रदर्शन के रूप में रात भर डायलिसिस के बाद, 60 सेंटीमीटर आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी कॉलम द्वारा 16 मिलीमीटर पर नमूने के पांच मिलीलीटर लोड करें। नमूना मात्रा के अनुसार, आवश्यक के रूप में दोहराना।
प्रति मिनट एक मिलीलीटर पर, और दो मिलीमोलर ट्रिस, 100 मिलीमोलर सोडियम क्लोराइड और दो मिलीमोलर डीडीटी समाधान पर। अंशों को खींचने के बाद, डिमरिक निमो-ईईएए के अनुरूप, 113 माइक्रोमोलर की अंतिम एकाग्रता के लिए तीन किलोडलटन की झिल्ली को आणविक वजन काटने के साथ, हड़कंपित सेल कंसंसेंटर में नमूना केंद्रित करें। फिर, एक महीने तक चार डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए प्रोटीन को अलीकोट करें।
विरल मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के लिए, एक दो बूंद चैंबर क्रिस्टलीकरण प्लेट के 96 कुओं में से प्रत्येक में विरल मैट्रिक्स समाधान के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें। बैठने के लिए और वाष्प प्रसार ड्रॉप। और एक रोबोट ड्रॉप सेटर के लिए प्रोटीन समाधान जोड़ें।
इसके बाद, एक रोबोट ड्रॉप सेटर का उपयोग करें, 1.65 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पर प्रोटीन समाधान के 100 नैनोलीटर को वितरित करने के लिए, ड्रॉप वन में जलाशय समाधान के साथ एक से एक अनुपात में, 200 नैनोलीटर की अंतिम मात्रा तक। और ड्रॉप दो में 200 नैनोलीटर की अंतिम मात्रा में जलाशय समाधान के 134 नैनोलीटर के साथ प्रोटीन समाधान के 66 नैनोलीटर जोड़ें। इसके बाद तुरंत तीन इंच चौड़े सीलिंग टेप से प्लेट को सील करें।
फिर, ट्रे को क्रिस्टलीकरण इमेजर स्टोरेज में 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्लेटों के भंडारण के दो दिन बाद शुरू होने वाले क्रिस्टल की उपस्थिति के लिए स्वचालित रूप से एकत्र की गई छवियों की जांच करना। बीज स्टॉक उत्पादन के लिए, ब्याज की क्रिस्टल युक्त पूरी बूंद को एक बीज पीढ़ी किट से प्रदान की गई शीशी में क्रिस्टलीकरण स्थिति समाधान के 50 माइक्रोलीटर में स्थानांतरित करें।
और भंवर बीज स्टॉक, स्पंदन के 20 सेकंड और आराम के 10 सेकंड के साथ, तीन मिनट के लिए । फिर, बीज स्टॉक को क्रमिक रूप से कमजोर करें, एक से 10 वेतन वृद्धि में, एक से 10, 000 तक नीचे। और आगे के उपयोग तक, चार डिग्री सेल्सियस पर कमजोर पड़ने की दुकान ।
सिंक्रोट्रॉन के लिए शिपमेंट से एक से दो दिन पहले, ब्याज के क्रिस्टल के साथ, कुएं के ऊपर से टेप काटें। और 12% एक, दो प्रोपेन डायो क्रायोप्रोटेक्टेंट युक्त क्रिस्टलीकरण समाधान के 0.5 माइक्रोलीटर सीधे अच्छी तरह से जोड़ें। धीरे-धीरे क्रायो लूप के साथ क्रिस्टल को उखाड़ फेंकना।
अच्छी तरह से क्रिस्टल लूप करें, और एक्स-रे विवर्तन के लिए शिपमेंट तक, तरल नाइट्रोजन में डूबे पक में क्रायो लूप युक्त क्रिस्टल स्टोर करें। एक्स-रे विवर्तन डेटा प्राप्त करने के बाद, स्टार और आईएसओ सर्वर में स्केल्ड तीव्रता को संसाधित करें। डेटा के लिए विवर्तन सीमा सतह के लिए एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी इंडेक्सिंग कट ऑफ मतलब का उपयोग करना, 1.2 का।
और फीनिक्स पर लोड । संरचना निर्धारित करने के लिए, फीनिक्स में MRage का उपयोग कर, आणविक प्रतिस्थापन के लिए एक खोज मॉडल के रूप में GCN4 के एक्स-रे संरचना का उपयोग करें । 4DMD संरचना, एक पहनावा के रूप में परिभाषित किया जाएगा ।
और MRage समाधान सफलतापूर्वक संरचना भाग के लिए निर्माण होगा, निमो-EEAA के अंत टर्मिनल कुंडलित-कुंडल एडाप्टर के अनुरूप । खोज मॉडल के लिए, डाइमर में दोनों जंजीरों के लिए। ओवर व्यक्त प्रोटीन एक बैंड पर दिखाई देता है, लगभग 14 किलोडलटन आणविक वजन मार्कर पर, पहले IMAC कॉलम शुद्धिकरण से पहले ।
और पहले एल्यूशन के बाद क्रमशः 14 और 28 किलोडडलटन में एक मोनोमर बैंड और एक डिमर बैंड प्रदर्शित करता है। TEV दरार व्यावहारिक रूप से पूरा हो गया है, एल्यूशन के बाद, दूसरे आईमैक कॉलम के माध्यम से। लगभग पूरी तरह से एक मंद के रूप में, अपेक्षित आणविक वजन पर।
आकार बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी, एक ही चोटी प्रदर्शित करता है, 60 से 65 मिलीलीटर के बीच, जो डाइमर का जवाब दे रहे हैं। ठीक स्क्रीनिंग क्रिस्टल है कि निमो के उत्पादन के लिए एक बीज स्टॉक का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है उत्पादन-EEAA क्रिस्टल, डेटा संग्रह के लिए पैदा करता है । यहां, प्रतिनिधि निमो-EEAA क्रिस्टल विवर्तन प्रोफाइल, दिखाया गया है ।
निमो-ईईएए प्रोटीन का संरचनात्मक विश्लेषण, एक होमोडिमरिक अनियमित समानांतर कुंडलित-कुंडली का पता चलता है, लंबाई में लगभग 175 एंग्स्ट्रॉम। नियमित कुंडलित-कुंडली क्षेत्र, अंत टर्मिनस पर आदर्श कुंडलित-कुंडली एडाप्टर अनुक्रम को शामिल करता है। और निमो उचित अनुक्रम के पहले दो हेप्टेड ।
एक नियमित कुंडली-कुंडली, सी टर्मिनस में भी मौजूद है। निमो अवशेष 97 से शुरू होकर सी टर्मिनल आदर्श कुंडलित-कॉइल एडाप्टर को शामिल करना। IKK बीटा बाध्य संरचना, लिगांड को समायोजित करने के लिए एक अधिक खुली कुंडल-कुंडल पुष्टि प्रदर्शित करता है।
इस क्षेत्र में एक से 2.2 एंग्स्ट्रॉम तक एक बड़ा इंटरहेलिकल अंतर है। निमो में एक लिगामेंट की संरचना, कम्प्यूटेशनल तरीकों के माध्यम से अवरोधकों के डिजाइन के लिए एक नया लक्ष्य प्रदान करती है। और छोटे अणु पुस्तकालयों के साथ बाध्यकारी जेब के दृश्य स्क्रीनिंग के लिए ।
अब हमारे पास छोटे अणु लिगामेंट्स के साथ परिसर में इंजीनियर निमो निर्माण के क्रिस्टलीकरण के लिए एक रास्ता है। अवरोधकों के एक नए वर्ग के विकास और अनुकूलन में सहायता करना।
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