Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO
Chapters
Summary December 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse av IKK-bindende domene av NEMO av X-ray crystallography. Metodene omfatter protein uttrykk, rensing og karakterisering, samt strategier for vellykket krystall optimalisering og struktur bestemmelse av proteinet i sin ubundet form.
Transcript
Denne protokollen forenkler vellykket strukturbestemmelse av IKK-bindingsdomenet NEMO, i sin ubundet form. Og detaljer om produksjon og krystallisering. Protokollen, drar nytte av denne stabiliseringen av den opprinnelige bekreftelsen av IKK bindende domenefragment av NEMO, gjennom kveilet-coil adaptere, som letter krystallisering og struktur bestemmelse.
Den strukturelle biologien til NEMO, som mål, gir en viktig fordel i utviklingen av NEMO-hemmere for behandling av inflammatoriske og autoimmune sykdommer og kreft. Denne protokollen kan utvides til strukturen bestemmelse av NEMO komplekser, med peptid eller små molekylhemmere for narkotika oppdagelse eller optimalisering. Proteinet som er omgang og konsentrasjon, under proteinproduksjonsstadiet, er grunnleggende for å oppnå en ren NEMO-dimer.
Begrense aggregering og sikre løselighet under krystalliseringsforhold. Demonstrere prosedyrene vil være Tamar og Amy, graduate studenter i vårt laboratorium. Begynn med å legge til 20 milliliter med fantastisk kjøttkraftløsning.
Og 20 mikroliter av en 100 mg per milliliter lagerløsning av ampicillin. Til en 125 milliliter Erlenmeyer kolbe. Etterfulgt av noen mikroliter av celleglyserol lager, fra 80 grader Celsius lagring, av BL21DE3 kompetente celler.
Forvandlet med vektor. Etter å ha ristet startkulturen over natten, ved 37 grader Celsius og 220 rotasjoner per minutt, fortynne cellene til en OD600 på 0,1 og 250 milliliter med fantastisk kjøttkraft. Og tilsett ampicillin til en endelig konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter.
Når OD600 av kulturen når 0,8 til 1, legg IPTG til kulturen, til en 500 mikromolarkonsentrasjon. Og vokse cellene i fire timer, ved 37 grader Celsius, til OD600 når seks til 10. På slutten av inkubasjonen sedimenter cellene ved sentrifugering.
Og re-suspendere pellet i 40 milliliter lysis buffer. Del de re-suspenderte cellene i to 20 til 25 milliliter aliquots. Og bruk en fransk presse til å bruke ca 25,000 pounds per kvadrattomme trykk til cellene, to til tre ganger per aliquot, i et kaldt rom.
Deretter legger urea til cellelylatene, til en endelig konsentrasjon på åtte molar. Og inkuber celleløsningen på en gyngeplattform i to til 16 timer, ved romtemperatur. Neste morgen, overføre lysates til ultra-sentrifuge rør, til minst tre fjerdedeler full, per rør.
Og ulrta sentrifuge lysates, i 45 minutter. Dekanter supernativa i et 50 milliliter konisk rør. Og last urea inkubert supernatant på en IMAC-kolonne, med tre milliliter per minutt.
Når alle de supernatante har kjørt gjennom kolonnen, vask kolonnen for 10 kolonnevolumer, med bindingsbuffer, med tre milliliter per minutt. Og utfør gradient elution av NEMO-EEAA protein fra 10 til 500 millimolar imidazol, over en 12 kolonne volum gradient. Samle en milliliter aliquots av eluate, i en brøkdel samling plate.
Etter analyse av SDS-siden trekker du fraksjonene som inneholder det rene målproteinet og måler proteinkonsentrasjonen ved Bradford-analysen, i henhold til standardprotokollen. Velg de unnslappe brøkene som inneholder protein. For å holde HIS6-taggen og fjerne overflødig imidazol fra prøven, tilsett TEV protease, med ett til 10 vektforhold, av TEV spaltet protein, til målproteinprøven.
Og utvide prøven over natten i fire liter 20 millimolar Tris. 150 millimolar natriumklorid og to millimolar DTT oppløsning. Neste morgen laster du TEV-spaltet NEMO-EEAA-prøven, på en annen IMAC-kolonne, med en milliliter per minutt.
Samle flyten gjennom i en milliliter brøkdeler, i en 96 bolle brøk oppsamling plate. Vask kolonnen med fem volumer av 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumklorid og 10 millimolar imidazol løsning, på en milliliter per minutt. Etter siste vask, elute TEV og uncleaved HIS6 NEMO-EEAA, med tre kolonnevolumer på 20 millimolar Tris, 150 millimolar natriumklorid, 500 millimolar imidazol og to millimolar DTT løsning, i en 50 milliliter kolbe.
Trekk strømmen gjennom fraksjoner, som inneholder spaltede NEMO-EEAA konstruere og konsentrere prøven med en rørt cellekonsentrator, til fem milliliter. Etter natten dialyse som demonstrert, laste fem milliliter av prøven på 16 millimeter med 60 centimeter størrelse utelukkelse kromatografi kolonner. Gjentar etter behov, i henhold til prøvevolumet.
På en milliliter per minutt, og på to millimolar Tris, 100 millimolar natriumklorid og to millimolar DDT løsning. Etter å ha trukket fraksjonene, tilsvarende den dimeriske NEMO-EEAA, konsentrere prøven i den omrørte cellekonsentratoren, med en molekylvekt avskåret membran på tre kilodalton, til en endelig konsentrasjon på 113 mikromos. Deretter, aliquot proteinet for lagring på fire grader Celsius, i opptil en måned.
For sparsom matrisescreening, tilsett 60 mikroliter sparsom matriseløsning i hver av de 96 brønnene i en krystalliseringsplate med to dråper kammer. For sitte og slippe dampdiffusjon. Og legg til proteinløsningen til en robotsekistsetter.
Deretter bruker du en robotsekr dråpesetter, til å dispensere 100 nanoliter proteinoppløsning ved 1,65 milligram per milliliter, i et forhold med reservoarløsning i dråpe én, til et endelig volum på 200 nanoliter. Og tilsett 66 nanoliter proteinoppløsning med 134 nanoliter reservoaroppløsning, til et endelig volum på 200 nanoliter i dråpe to. Deretter forsegler du umiddelbart platen med tre tommers bred tetningstape.
Deretter lagrer du skuffene i en krystalliseringsbilderlagring, ved 20 grader Celsius. Sjekke bildene samlet automatisk, for tilstedeværelse av krystaller, starter to dager etter lagring av platene. For frølagergenerering, overfør hele dråpen som inneholder krystallen av interesse, til 50 mikroliter krystalliseringstilstandsløsning, i det medfølgende hetteglasset, fra et frøgenereringssett.
Og vortex frø lager, med 20 sekunder pulserende og 10 sekunder hvile, i tre minutter. Deretter fortynner du frøbeholdningen, i en til 10 trinn, ned til en til 10 000. Og lagre fortynningene ved fire grader Celsius, til videre bruk.
En til to dager før forsendelse til synchrotron, kutt båndet fra toppen av brønnen, med krystall av interesse. Og tilsett 0,5 mikroliter krystalliseringsløsning som inneholder 12%en, to propan DiO kryobeskyttende, direkte til brønnen. Løsne krystallen forsiktig med en kryosløyfe.
Loop krystallen fra brønnen, og lagre krystallen som inneholder kryosløyfe i en puck nedsenket i flytende nitrogen, til forsendelse for røntgendiffraksjon. Etter å ha mottatt røntgendiffraksjonsdataene, behandler du de skalerte intensitetene i STAR- og ISO-serveren. Ved hjelp av en røntgenkrystallografi indeksering avskåret gjennomsnitt, av 1,2 for diffraksjon grensen overflaten for dataene.
Og last på Phoenix. For å bestemme strukturen, bruk røntgenstrukturen til GCN4 som en søkemodell for molekylær erstatning, ved hjelp av MRage i Phoenix. 4DMD-strukturen, vil bli definert som et ensemble.
Og MRage-løsningen vil med hell bygge til strukturdelen, tilsvarende endeterminalen coiled-coil adapter av NEMO-EEAA. søkemodellen, for begge kjedene i dimeren. Det over uttrykte proteinet vises på et bånd, med ca. 14 kilodaltonmolekylærvektmarkør, før den første IMAC-kolonnerensingen.
Og viser et monomerbånd og et dimerband, henholdsvis 14 og 28 kilodaltonn, etter den første elutionen. TEV cleavage er praktisk talt komplett, etter elution, gjennom den andre IMAC-kolonnen. Nesten helt som en dimer, ved forventet molekylær vekt.
Størrelse eksklusjon kromatografi, viser en enkelt topp, unnviker mellom 60 til 65 milliliter, som reagerer på dimer. Fin screening produserer krystaller som kan brukes til å produsere en frø lager for produksjon av NEMO-EEAA krystaller, for datainnsamling. Her vises representative NEMO-EEAA krystaller diffraksjonsprofiler.
Strukturell analyse av NEMO-EEAA-proteinet, avslører en homodimerisk uregelmessig parallell kveilet spole, ca. 175 angstroms i lengde. Den vanlige kveilet-coil regionen, omfatter den ideelle kveilet-coil adapter sekvens, på slutten terminus. Og de to første heptads av NEMO riktig sekvens.
En vanlig kveilet spole, er også til stede på C terminus. Starter ved NEMO rester 97 og omfatter C-terminalen ideell kveilet-coil adapter. IKK beta bundet struktur, viser en mer åpen kveilet-coil bekreftelse, for å imøtekomme ligand.
Med en større interhelical avstand med en til 2,2 angstroms i denne regionen. Strukturen til en ligand i NEMO, tilbyr et nytt mål for utforming av inhibitorer gjennom beregningsmetoder. Og for visuell screening av bindende lommer med små molekylbiblioteker.
Vi har nå en bane for krystallisering av den konstruerte NEMO-konstruksjonen i kompleks med små molekylligander. For å hjelpe til med å utvikle og optimalisere en ny klasse inhibitorer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
