Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden
Chapters
Summary October 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Een protocol voor het genereren van menselijke primaire endometriale organoïden die bestaan uit epitheliale en stromale cellen en behouden kenmerken van het inheemse endometrium weefsel wordt gepresenteerd. Dit protocol beschrijft methoden van uteriene weefsel verwerving tot de histologische verwerking van endometriale organoïden.
Transcript
Het endometrium is een weefsel dat elke maand verandert in reactie op hormonen. Hormoon onbalans kan voorkomen dat embryo gehechtheid en ook ziekten zoals kanker veroorzaken. Ons protocol herbouwt het endometrium zodat het op fysiologische wijze buiten het lichaam van de vrouw kan worden bestudeerd.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een 3D-structuur van cellen bestaat uit twee hormonaal responsieve celtypes, de epitheliale en stroma cellen die specifiek organiseren en gedragen zoals ze doen in het lichaam. Omdat de organoïden weefselgedrag beter kunnen nabootsen, kunnen ze uiteindelijk worden gebruikt om verschillende geneesmiddelen te testen. De endometriumorganoïden kunnen worden gebruikt om directe effecten van de momenteel bekende risicofactoren voor kanker te bestuderen, waaronder obesitas en polycystend eierstoksyndroom.
Onze organoïden benadrukken het belang van paracrineacties tussen twee celtypen. Het is belangrijk om te beginnen met een voldoende hoeveelheid weefsel. Het verkrijgen van de juiste dichtheid van epitheliale en stromal cellen kan lastig zijn.
Ook de organoïden zijn vrij klein en kan moeilijk te visualiseren met IHC kleuring. Visualisatie van deze procedure is belangrijk omdat er een aantal stappen die veel gemakkelijker te begrijpen na het zien van hen. Deze omvatten het krijgen van de juiste weefsellaag van de baarmoeder, het krijgen van de juiste dichtheid van cellen te combineren, en zaaien van de agarose schimmels.
Voordat u begint met celisolatie, gegoten en equilibrate 1,5%agarose micro-mallen volgens de instructies van de fabrikant om de organoïden huis. Gebruik in een bioveiligheidskast aseptische technieken om een enzymoplossing op 37 graden Celsius voor te bereiden en steriel filter de oplossing met behulp van een spuitfilter van 0,2 micrometer in een conische buis van 15 milliliter. Met behulp van een scalpel, schraap endometrium uit de baarmoeder biopsieën en gehakt het weefsel in zeer kleine stukjes.
Plaats het vers gehakte weefsel in de 15-milliliter conische buis met de enzymoplossing. Sluit de dop en wikkel de bovenkant van de buis met een wax film om besmetting te voorkomen. Plaats de buis in een waterbad of couveuse op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten met zachtjes schudden.
Stapel hierna een 100-micron celzeef op een 20-micron celzeef op een conische buis van 50 milliliter. Filter de oplossing door de twee strainers. Spoel de 15-milliliter conische buis met HBSS en zet deze was door de zeef om ervoor te zorgen dat alle cellen worden verzameld.
Draai vervolgens de 20-micron celzeef om op een nieuwe conische buis van 50 milliliter en was de epitheelcellen van de zeef met 20 milliliter organoïde media aangevuld met 1%penicilline en streptomycine. Centrifuge de conische buizen op 500 G gedurende vijf minuten. Voor de verzamelde stromalcellen, verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 10 milliliter van rode bloedcel lyse buffer.
Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 10 tot 15 minuten. Centrifugeren deze cellen op 500 G gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en resuspend de pellet met 200 tot 300 microliter van organoïde media.
Voor verzamelde epitheelcellen, verwijder de supernatant en resuspend de pellet in 100 microliterten van organoïde media. Nadat de 1,5% agarose mallen zijn geëquilibreerd, verwijder de organoïde media aan de buitenkant van de agarose mallen en kantel de weefselkweekplaat, zodat het medium uit de celzaaikamer van de agarose gerechten ook zorgvuldig kan worden verwijderd. Bekijk de epitheliale en stromale celsuspensies onder een microscoop en voeg meer organoïde media toe aan de suspensies, waarbij u ervoor zorgt dat u slechts 100 microliters tegelijk toevoegt, zodat de suspensie ongeveer gelijk is aan dichtheid.
Combineer vervolgens een deel van de stromale cellen met drie delen van de epitheliale cellen in volume. Pipette 50 microliters van de gecombineerde celsuspensie in de celzaaikamer van de agarosemal. Zodra de agarose mallen zijn gevuld met cellen, zorgvuldig toe te voegen 400 microliter van verse organoïde media in de putten van de 24-well plaat.
Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide, zorg ervoor dat het medium elke tweede dag verandert met 500 microliter organoïde media. Na zeven dagen, verander het medium naar een die wordt aangevuld met 0,1 nanomolar estradiol en 0,8 nanomolar testosteron ter bevordering van de organisatie van de epitheliale en stromale cellen. Los eerst 1,5% agarose op in PBS door te koken.
Plaats de vloeistof agarose in een bekerglas van warm water en laat het afkoelen tot ongeveer 50 graden Celsius. Onder een ontledenmicroscoop, kantelen de 24-well plaat en zorgvuldig pipette uit het medium van de buitenkant van de agarose schimmel. Dan voorzichtig pipette uit het medium uit het interieur van de agarose schimmel om te voorkomen dat het verstoren van de organoïden.
Voeg voorzichtig tussen de 70 en 75 microliter warme, 1,5% agarose toe in de kamer van de agarose schotel, voorzichtig om de organoïden niet te verstoren. Laat de plaat vijf minuten afkoelen op vier graden Celsius. Voeg hierna 4% paraformaldehyde toe aan elke put van de 24-putplaat en bevestig de hele verzegelde agarose-mal 's nachts bij vier graden Celsius.
De volgende dag, bewaar de plaat in 70% ethanol op vier graden Celsius tot klaar om te verwerken voor paraffine inbedding. Om te beginnen RNA isolatie, bekijk de plaat onder een ontleden microscoop. Kantel de plaat en voorzichtig pipette uit het medium uit de kamer van de agarose schimmel.
Krachtig pipette een milliliter van verse organoïde medium direct in de agarose schimmel, zodat de organoïden worden gespoeld uit de microwells, voorzichtig niet te veel bubbels te creëren. Herhaal dit krachtige pipettingproces eenmaal met hetzelfde medium. Verzamel hierna al het medium met de organoïden.
Centrifuge bij 500 G om de organoïden te verzamelen en over te gaan tot RNA-extractie. In deze studie worden menselijke endometriumorganoïden bestaande uit epitheliale en stromalcellen van het endometrium gegenereerd zonder het gebruik van exogene steigermaterialen. Voor histologische verwerking worden de agarosemallen die de endometriumorganoïden bevatten verzegeld met agarose, gevolgd door fixatie met 4% paraformaldehyde 's nachts.
Deze mallen worden verwerkt voor standaard paraffine inbedding geneude en gekleurd voor histologie, immunofluorescentie, of immunohistochemie. De hematoxyline in eosine kleuring onthult een sferoïde-achtige structuur met een enkele laag cellen langs de buitenkant en cellen in het midden. Celspecifieke markers voor endometrium-, epitheliale en stromale cellen onthullen epitheliale cellen rond de organoïde met stromale cellen in het midden.
Markers van endometriumfysiologie bevestigen dat de endometriumorganoïden bepaalde kenmerken van het inheemse weefsel behielden. Tri-chroom kleuring, die vlekken collageen blauw en cellen rood, toont de aanwezigheid van collageen in het centrum waar stromale cellen verbleven, waaruit blijkt actieve productie en afscheiding van collageen door stromale cellen vergelijkbaar met het inheemse weefsel. Bovendien, immunohistochemische kleuring onthult de aanwezigheid van oestrogeenreceptoren, androgeen receptoren, en progesteron receptoren in zowel de epitheliale en stromale cellen.
Het is belangrijk om de cellen dicht te borderen, zodat we genoeg organoïden hebben voor downstream experimenten. Dit zal enige oefening vereental. Endometriumorganoïden kunnen onder verschillende omstandigheden worden gekweekt en vervolgens worden geoogst voor experimenten zoals immunohistochemie of immunofluorescentiekleuring om eiwitexpressie te bestuderen of geoogst te worden voor RNA om genexpressie te bestuderen.
Ons lab onderzoekt hoe het endometrium reageert op veranderde hormoonspiegels, wat kan leiden tot endometriumhyperplasie en kanker. We kunnen deze organoïden gebruiken voor langdurige behandelingen van hormonen en pathologische aandoeningen toevoegen, zoals teveel testosteron gevonden in polycystend eierstoksyndroom, of signalen van adipocyten om door obesitas geïnduceerde endometriumveranderingen te bestuderen. Menselijke weefsels worden beschouwd als biogevaarlijk, en het zal belangrijk zijn om passende voorzorgsmaatregelen te nemen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
