Chemistry
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Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza
Chapters
Summary February 6th, 2020
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Viene presentato un protocollo per la sintesi di oligomeri peptoidi codificati in informazioni e per l'autoassemblaggio di questi peptoidi diretti in sequenza in scale molecolari utilizzando ammine e aldeidi come coppie dinamiche di reazione covalenti e Lewis acida rara terra triflates in metallo come reagenti multiruolo.
Transcript
Questo protocollo consente l'assemblaggio diretto dall'informazione di sequenze oligomeriche mediante interazioni covalenti dinamiche, imitando realmente l'ibridazione selettiva della sequenza degli acidi nucleici ma con una maggiore forza di legame interstrando. Gli assiemi covalenti dinamici sono in genere limitati a architetture semplici a causa della loro limitata capacità di riarrangiamento delle obbligazioni e correzione degli errori. Al contrario, aumentando lungo la concentrazione di un acido di Lewis per influenzare la dissociazione del legame e successivamente catalizzare il riarrangiamento del legame, questa tecnica mitiga i limiti prevalenti di intrappolamento cinetico dei sistemi di auto-assemblaggio.
Questo metodo potrebbe essere utilizzato in una varietà di campi che utilizzano reazioni di riarrangiamento del legame covalente, dalle struttura organiche covalenti con tassi di difetti eccezionalmente bassi alle interfacce dei tessuti biomateriali che sono in grado di adattarsi e adattarsi al continuo rimodellamento del substrato tissutale. Quando si esegue questa tecnica per la prima volta, gli individui possono trovare assiemi intrappolati cineticamente anche dopo lunghi tempi di ricottura. Consigliamo agli utenti per la prima volta di tentare le ibridazioni tra oligomeri che portano esclusivamente aldeide ed esclusivamente residui di ammina, semplificando le informazioni codificate e quindi l'ibridazione.
Per iniziare questa procedura, pesare 0,125 grammi di resina di supporto solido fotolabile FMOC e aggiungerla a un contenitore di reazione del sintetizzatore automatizzato fritte. Inserire il recipiente nella parte a microonde del sintetizzatore. Riempire la bottiglia principale di solvente con DMF e la bottiglia di deprotezione con una soluzione di 20%4-metilpiperidina in DMF e svuotare i rifiuti.
Successivamente, preparare una soluzione molare di acido bromoacetico e DIC in DMF con volumi totali di 1,5 millilitri per ogni residuo in sequenza e 0,47 millilitri di anidride acetica a 4,53 millilitri di DMF per fare una soluzione di capping a cinque millilitri. Preparare 0,5 soluzioni molare di ogni ammina primaria da utilizzare in NMP. Il volume totale di ciascuna soluzione deve essere di 2,5 millilitri per ogni residuo dell'ammina primaria appropriata più altri 2,5 millilitri.
Aggiungi tutte le soluzioni al collettore automatico del sintetizzatore. Utilizzando un sintetizzatore peptidico automatizzato, gonfiare la resina, scindere il gruppo FMOC ed eseguire la reazione di spostamento come delineato nel protocollo di testo. Successivamente, salinizzare le pareti di un recipiente di reazione in vetro fritte dotato di un fermaglio a tre velocità riempierlo in cima con una soluzione di 5%diclorodimetilsilano in DCE.
Lasciare riposare per 30 minuti, quindi scolare il recipiente e lavarlo con DCE e metanolo. Dopo che il recipiente è asciutto, trasferire la resina ad esso. Lavare la resina tre volte con DCM utilizzando cinque millilitri per ogni lavaggio mentre si gorgoglia con gas azoto attraverso un braccio e si tira sottovuoto con un altro.
Asciugare e conservare la resina e l'oligopeptoide attaccato fino a deprotezione e scissione. Quando è pronto per continuare, rigonfiare la resina se è stata conservata per più di un giorno gorgogliandola con cinque millilitri di DMF per 10 minuti. Scolare il recipiente e aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica e tre millilitri di DCM secco al recipiente peptidico di vetro.
Pesare 0,1 equivalenti del catalizzatore palladio e 25 equivalenti di fenilsilano per gruppo alloca. Utilizzare un morsetto per posizionare il recipiente di reazione ad un angolo superiore alla piastra di agitazione in modo che la resina subisca un'agitazione delicata pur rimanendo sospesa nel solvente e cappuccio il recipiente per evitare che il DCM evapori. Dopo un'ora, filtrare la soluzione e lavare la resina tre volte con DCM utilizzando cinque millilitri per lavaggio.
Quindi, ripetere ancora una volta la deprotezione alloc. Successivamente, sciacquare la resina in sequenza con metanolo e DCM due volte e trasferire la resina e la barra di agitazione magnetica in una fiala da 20 millilitri. Immergere la resina in DMF, mescolare e scindere come delineato nel protocollo di testo.
Quindi, utilizzare un filtro siringa per separare l'oligopeptoide liberato dalla resina e rimuovere il solvente sotto vuoto. Ricostituire i peptoidi in una miscela 50-50 di acqua e acetonitrile e purificare con HPLC preparativo in fase invertita. Unire le frazioni purificate, quindi congelarle e liofilizzare per produrre una polvere biancastra.
Analizzare la polvere con spettrometria di massa ESI e MALDI. Per valutare la purezza, eseguire HPLC analitici degli oligopeptoidi purificati. In primo luogo, preparare soluzioni stock da 10 millimolari di ogni sequenza oligopeptoide utilizzata per l'auto-assemblaggio e una soluzione di stock di 10 millimolare di triflato di scandio in acetonitrile anidro.
Aggiungere 20 microlitri di ogni soluzione di calcio peptoide a una fiala da tre millilitri dotata di una barra di agitazione magnetica. Aggiungere 1,5 equivalenti della soluzione di triflate di scandio per potenziale legame ammina dalla soluzione stock e aggiungere abbastanza acqua e acetonitrile per formare 200 microlitri di una soluzione di acqua e acetonitrile al 2%. Mescolare delicatamente a 70 gradi Celsius per due ore per la deprotezione acetile dell'aldeide e la dissociazione di tutti i filamenti.
Successivamente, caricare la fiala con 200 microlitri di cloroformio e due millilitri di acqua. Agitare delicatamente la fiala. Lasciare riposare la miscela per almeno 15 minuti.
Al termine della separazione di fase, estrarre lo strato organico con una siringa a microliter. Trasferire lo strato organico su una nuova fiala e mescolare a 70 gradi Celsius per la ricottura degli oligomeri che in genere richiede sei ore. Per dimostrare la capacità dei peptoidi codificati in informazioni di sottoporsi all'auto-assemblaggio covalente dinamico selettivo in scale molecolari, un filamento rappresentativo viene sintetizzato e ibridato con la sua sequenza peptoide complementare.
I monomeri NPAM e NPAL sono impiegati come coppie reagenti covalenti dinamiche con NEEE che aiutano la solubilità dei prodotti finali auto-assemblati. Al termine della sintesi dei sottomonomeri in fase solida, il gruppo alloc viene rimosso. Prima e dopo la deprotezione, porzioni della resina sono state scisse sotto la luce di 405 nanometri e caratterizzate da spettrometria di massa di ionizzazione elettrospray.
La sequenza viene purificata dalla preparazione HPLC, quindi liofilizzata per ottenere una polvere biancastra e la purezza è confermata con HPLC analitico. L'oligopeptoide viene successivamente ibridato con la sua sequenza complementare per permettersi una scala in registro confermata da MALDI-MS. Quando si esegue questa procedura, ricordarsi di concedere tempo sufficiente per i livelli completamente separati fino a quando la frazione acquosa diventa trasparente, almeno 15 minuti per garantire un'estrazione sufficiente del catalizzatore.
Dopo aver completato questa procedura di assemblaggio, la spettrometria di massa deve essere eseguita per determinare l'estensione dell'ibridazione. Inoltre, la spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente o la NMR al fluoro possono essere utilizzate per valutare la concentrazione di scandio dopo l'estrazione. Mentre questa tecnica è stata recentemente sviluppata, prevediamo che l'approccio biomimetico descritto nel nostro lavoro sarà determinante per dirigere la progettazione futura e l'assemblaggio diretto dall'informazione di nanostrutture complesse.
Molti dei reagenti qui utilizzati sono pericolosi. Si prega di prestare attenzione quando si maneggiano queste o qualsiasi altra sostanza chimica. Indossare tutti i dispositivi di protezione individuale ed eseguire tutti gli esperimenti all'interno di una cappa aspirante.
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