Chemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
توليف البببتيدات الحاملة للمعلومات والتجميع الذاتي الديناميكي المنضدي الموجه للتسلسل
Chapters
Summary February 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
يتم تقديم بروتوكول لتركيب أوليغوس اتبرويد مشفرة بالمعلومات وللتجميع الذاتي الموجه للتسلسل من هذه الببيدويدات في سلالم جزيئية باستخدام الأمينات والألدهيدات كأزواج ديناميكية متفاعلة التكافؤ ولويس الحمضية النادرة الأرض المضخات المعدنية ككواشف متعددة الأدوار.
Transcript
هذا البروتوكول يتيح تجميع المعلومات الموجهة من تسلسل القلة من التفاعلات التساهمية الديناميكية ، ومحاكاة حقا التهجين تسلسل انتقائية من الأحماض النووية ولكن مع زيادة قوة السندات بين العلامات التجارية. وعادة ما تقتصر الجمعيات التشاركية الديناميكية على البنيات البسيطة بسبب قدرتها المحدودة على إعادة ترتيب السندات وتصحيح الأخطاء. وعلى النقيض من ذلك، من خلال رفع تركيز حمض لويس للتأثير على تفكك السندات وتحفيز إعادة ترتيب السندات في وقت لاحق، تخفف هذه التقنية من قيود التراكب الحركي السائدة في أنظمة التجميع الذاتي.
يمكن استخدام هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من المجالات التي تستخدم تفاعلات إعادة ترتيب السندات التكافؤ ، من الأطر العضوية التكافؤ مع معدلات عيب منخفضة بشكل استثنائي إلى واجهات الأنسجة الحيوية القادرة على التكيف واستيعاب إعادة عرض مستمر لركيزة الأنسجة. عند تنفيذ هذه التقنية للمرة الأولى، قد يجد الأفراد تجمعات محصورة الحركية حتى بعد أوقات التلين المطولة. وننصح المستخدمين لأول مرة بمحاولة التهجين بين القلة التي تحمل حصرا الألدهيد وبقايا الأمين حصرا، وتبسيط المعلومات المشفرة وبالتالي التهجين.
لبدء هذا الإجراء، تزن 0.125 غراما من FMOC فوتولابايل الراتنج الدعم الصلبة وإضافته إلى وعاء رد فعل المزج الآلي fritted. أدخل الوعاء في الجزء الميكروكروميك من المزج. ملء زجاجة المذيبات الرئيسية مع DMF وزجاجة deprotection مع حل 20٪ 4-ميثيلبيريدين في DMF وإفراغ النفايات.
بعد ذلك، قم بإعداد محلول مولوي واحد من حمض بروم أوسيتيك و DIC في DMF مع أحجام إجمالية قدرها 1.5 ملليلتر لكل بقايا في التسلسل و 0.47 ملليلتر من أنهيدريد الخل إلى 4.53 ملليلتر من DMF لصنع محلول 5 ملليلتر. إعداد 0.5 حلول الولي لكل أمين الأولية لاستخدامها في NMP. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي لكل حل 2.5 ملليلتر لكل بقايا من أمين الابتدائية المناسبة بالإضافة إلى 2.5 ملليلتر إضافية.
إضافة جميع الحلول إلى المزج الآلي متعددة. باستخدام المزج الببتيد الآلي، تضخم الراتنج، ينشق مجموعة FMOC، وتنفيذ رد فعل النزوح كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد ذلك، ملح جدران وعاء رد فعل الزجاج fritted مجهزة stopcock ثلاثية الاتجاه عن طريق ملئه إلى الأعلى مع حل 5٪ ثنائي كلوروديميثيلسيلين في DCE.
السماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة ثم استنزاف السفينة وغسلها مع DCE والميثانول. بعد أن يكون الوعاء جافًا ، قم بنقل الراتنج إليها. غسل الراتنج ثلاث مرات مع DCM باستخدام خمسة ملليلتر لكل غسل في حين محتدما مع غاز النيتروجين من خلال ذراع واحدة وسحب الفراغ مع آخر.
الجافة وتخزين الراتنج و oligopeptoid المرفقة حتى إزالة الحماية والانقسام. عندما تكون على استعداد لمواصلة, إعادة تنتفخ الراتنج إذا كان قد تم تخزينها لأكثر من يوم واحد عن طريق محتدما مع خمسة ملليلتر من DMF لمدة 10 دقائق. استنزاف السفينة وإضافة شريط صغير يحرك المغناطيسي وثلاثة ملليلتر من DCM الجافة إلى وعاء الببتيد الزجاج.
تزن 0.1 ما يعادل محفز البلاديوم و 25 ما يعادلها من فينيلسيلين لكل مجموعة alloc. استخدام المشبك لوضع وعاء رد الفعل في زاوية فوق لوحة ضجة بحيث يخضع الراتنج التحريض لطيف في حين تبقى معلقة في المذيبات وغطاء السفينة لمنع DCM من التبخر. بعد ساعة واحدة، تصفية قبالة الحل وغسل الراتنج ثلاث مرات مع DCM باستخدام خمسة ملليلتر في غسل.
ثم، كرر إزالة الحماية alloc مرة أخرى. بعد ذلك، شطف الراتنج بالتسلسل مع الميثانول وDCM مرتين ونقل الراتنج والمغناطيسية شريط اثارة إلى 20 ملليلتر قارورة. غمر الراتنج في DMF ، ويحرك ، ويشد كما هو مبين في بروتوكول النص.
ثم، استخدام مرشح حقنة لفصل oligopeptoid المحررة من الراتنج وإزالة المذيبات تحت فراغ. إعادة تكوين peptoids في خليط 50-50 من الماء و acetonitrile وتنقية مع عكس مرحلة إعداد HPLC. الجمع بين الكسور النقية، ثم تجميد وlyophilize لهم أن تسفر عن مسحوق أبيض.
تحليل مسحوق مع ESI وقياس الطيفية الكتلة MALDI. لتقييم النقاء، قم بإجراء HPLC التحليلية من oligopeptoids المنقى. أولاً، إعداد حلول مخزون 10 ملليمولر من كل تسلسل oligopeptoid تستخدم للتجميع الذاتي وحل مخزون 10 ملليمولار من الزريفات المبيديوم في الأسيتونيتيريل اللامائية.
أضف 20 ميكرولترات من كل محلول من الأسهم peptoid إلى قارورة ثلاثة ملليلتر مجهزة ببار مغنطيسي. إضافة 1.5 ما يعادل من محلول التفاهات الممدنوم لكل السندات أمين المحتملة من محلول الأسهم وإضافة ما يكفي من الماء و acetonitrile لتشكيل 200 ميكرولترات من 2٪ من الماء وحل الأسيتونيتريل. يُحرّك بلطف عند درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين لdeprotection الأسيتيل من الألدهيد والتفكك من جميع الخيوط.
بعد ذلك، اُسخن القارورة بـ 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ومليلترين من الماء. هز القارورة بلطف. السماح للخليط لتقف لمدة 15 دقيقة على الأقل.
عند فصل المرحلة الكامل ، استخراج الطبقة العضوية مع حقنة microliter. نقل طبقة العضوية إلى قارورة جديدة ويحرك في 70 درجة مئوية لال oligomer الصلب الذي يستغرق عادة ست ساعات. لإثبات قدرة الببتويدات المشفرة للمعلومات على الخضوع للتجميع الذاتي الديناميكي الديناميكي المتتابع في سلالم جزيئية ، يتم تصنيع حبلا تمثيلي وتهجينه مع تسلسله الببتويدي التكميلي.
يتم استخدام MONOMERS NPAM وNPAL كأزواج تتفاعل ثنائية ثنائية ديناميكية مع NEEE تساعد على ذوبان المنتجات النهائية ذاتية التجميع. عند الانتهاء من تركيب الطور الفرعي، تتم إزالة مجموعة الـ alloc. قبل وبعد إزالة الحماية، كانت أجزاء من الراتنج مشقوقة تحت 405 نانومتر ضوء وتتميز بالمقياس الطيفي الكتلي المؤين للرذاذ الكهربائي.
يتم تنقية التسلسل من قبل HPLC الإعدادية، ثم lyophilized لتحقيق مسحوق أبيض ونقاء وأكد مع HPLC التحليلية. ويُهجَّن القلة في وقت لاحق بسلسلة تكميلية منه لتحمل سلم التسجيل الذي أكدته MALDI-MS. عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أن تسمح بوقت كاف للطبقات منفصلة تماما حتى يصبح الكسر مائي شفافة، على الأقل 15 دقيقة لضمان استخراج محفز كاف.
بعد الانتهاء من هذا الإجراء التجميع، ينبغي إجراء قياس الطيف الشامل لتحديد مدى التهجين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي الكتلي البلازما أو الفلور NMR مقرونة بشكل حثائي لتقييم تركيز الاسكندنيوم بعد الاستخراج. في حين تم تطوير هذه التقنية مؤخرا ، فإننا نتوقع أن نهج المحاكاة الحيوية الموصوفة في عملنا سيكون له دور فعال في توجيه المستقبل تصميم والمعلومات الموجهة تجميع الهياكل النانوية المعقدة.
العديد من الكواشف المستخدمة هنا خطرة. يرجى توخي الحذر عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية أو أي مواد كيميائية أخرى. ارتداء جميع معدات الحماية الشخصية وإجراء جميع التجارب داخل غطاء محرك الدخان.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
