Login processing...

JoVE Journal
Immunology and Infection

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Immunology and Infection

Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Journal (Immunology and Infection)

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

Avian Influenza Surveillance with FTA Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Journal (Immunology and Infection)

Avian Influenza Surveillance with FTA Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Click here for the English version

Antibiotika-Dereplication ved hjælp af antibiotikaresistens platformen

Article DOI: 10.3791/60536-v

October 17th, 2019 •

Haley L. Zubyk¹, Georgina Cox², Gerard D. Wright¹

¹Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, M.G. DeGroote Institute for Infectious Disease Research, McMaster University, ²Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

October 17th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en platform, der udnytter et bibliotek af isogene antibiotikaresistente Escherichia coli til dereplication af antibiotika. Identiteten af et antibiotikum produceret af bakterier eller svampe kan udledes af væksten af E. coli udtrykker sin respektive resistens gen. Denne platform er økonomisk effektiv og tidsbesparende.

Transcript

Vores protokol er vigtig, fordi det giver mulighed for både omkostningseffektiv og rettidig dereplication af kendte antibiotika uden brug af specialiseret udstyr. Den største fordel ved denne teknik er skabelontilpasning. Det betyder, at en person kan skræddersy, hvilke resistensgener, som de ønsker at medtage i deres biblioteksskabelon baseret på deres ønskede niveau af bred eller smal substratspecifikitet.

For eksempel er en beta-lactam udtrykker E.coli skabelon kan fremstilles for at give mulighed for den meget specifikke dereplication af beta-lactams og deres forskellige underklasser. Ved hjælp af en septisk teknik, pipette 500 mikroliter af kation justeret MHB fra en steril reservoir i hver brønd af en steril, 96 dyb brønd plade. Med de forberedte ARP- eller MARP-stammeplader skal du bruge en applikatorpind til at vaccinere den 96 dybe brøndplade i overensstemmelse med ARP- eller MARP-kortet.

Placer en åndbar tætning membran på overfladen af den dybe godt plade og inkubere det natten over ved 37 grader Celsius, 250 RPM. Sørg for, at der ikke er forurenede brønde. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 100 mikroliter fra hver brønd af den dybe godt plade til en steril 96-godt runde bundplade.

Tilsæt 100 mikroliter steril 50% glycerol i hver brønd og bland ved forsigtigt pipettering op og ned. Forbered mindst fem bibliotekstaller. Dæk pladerne med sterile aluminiumstætninger og sørg for, at hver brønd er individuelt forseglet.

Placer pladelåget oven på aluminiumstætningen og opbevar den på minus 80 grader Celsius. Ved hjælp af en træ applikator stick, forsigtigt skrabe sporer fra overfladen af en streptomyces koloni og overføre det til et reagensglas, der indeholder en steril glas perle og tre milliliter streptomyces antibiotika medium. Reagensglasset lukkes løst med en hætte, så der kan besørges.

Brug den samme træ applikator stick, streak en sterilitet kontrol på en petriskål, der indeholder Bennett's agar. Inkuber røret indeholdende frøkultur ved 30 grader Celsius med belægning i seks dage ved 250 RPM og sterilitetskontrolpladen ved 30 grader Celsius i seks dage. Derefter, på en plan overflade, forberede dereplication plader.

Aspirere 23 milliliter varm Bennett's agar i en serologisk pipette og dispensere 20 milliliter jævnt over overfladen af en rektangulær petriskål, forlader resten af mediet i pipetten for at forhindre luftbobledannelse. Dæk pladen med et låg. Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle områder af pladen, og forstyr den ikke, før agaren er helt indstillet.

Dernæst forberede nitrocellulose membran ark ved hjælp af en rektangulær Petriskål låg som en opsporing skabelon, således at arkene passer til overfladen af dereplication plade. Skær arkene og autoklave dem i en steril pose. Kontroller nu sterilitetskontrolpladen for at sikre, at der ikke er forurenende stoffer til stede efter seks dages inkubation.

Hvis forureningsfri fjernes låget på den rektangulære petriskål og pipette 200 mikroliter af frøkulturen på overfladen af Bennetts agar i den rektangulære skål. Brug en steril vatpind til jævnt at sprede kulturen over hele pladens overflade. For at placere den forberedte nitrocellulosemembran over toppen af kulturen på overfladen af petriskålen, justeres membranens nederste kant til den nederste kant af petriskålen, og membranen påføres langsomt fra den nederste kant til pladens øverste kant.

Brug en steril vatpind til at udjævne eventuelle luftbobler, der kan have dannet mellem membranen agar interface, sikre, at membranen er skyllet til agaren. Membranen giver mulighed for organismer til at sporulere på dens overflade, mens sekundære metabolitter kan udskilles i mediet nedenfor. Læg låget tilbage på den rektangulære petriskål, og læg det på hovedet i en forseglet plastikpose.

Inkubere ved 30 grader Celsius i seks dage. Efter seks dage fjernes dereplicationspladen fra inkubatoren. Ved hjælp af sterile pincet fjernes nitrocellulosemembranen forsigtigt fra overfladen af Bennetts agar.

Sørg for, at der kun er mindre spore vækst omkring kanterne af pladen for at mindske chancerne for at forurene overlejring, der skal tilføjes. Sørg for, at arbejdsfladen er plan, og brug en serologisk pipette til at aspirere 23 milliliter varm kationjusteret MHB agar. Opret en overlay ved at dispensere 20 milliliter jævnt over overfladen af dereplicationspladen, så resten af agaren i pipetten for at forhindre luftbobledannelse.

Læg låget på pladen. Drej forsigtigt pladen, indtil mediet dækker alle områder, og forstyr den ikke, før agaren er helt indstillet. Når afkølet og størknet, returnere dereplication plade til forseglet plastpose og gemme det på hovedet ved fire grader Celsius natten over, giver mulighed for diffusion af sekundære metabolitter i MHB agar overlay.

Samme dag skal du vaccinere en frisk ARP- eller MARP-skabelon ved først at pipettere 100 mikroliter kationjusteret MHB i hver brønd af en 96-brøndplade. Tag den frosne bestand ARP eller MARP bibliotek plade ud af minus 80 grader Celsius fryser. Fjern aluminiumsforseglingen, før kondens begynder at dannes på undersiden.

Brug sterile 96-brønd pinning værktøjer, omhyggeligt pin fra den frosne bestand ARP eller MARP bibliotek plade og inokulere den friske MHB indeholder 96-brønd plader. For at minimere forurening under dereplication, forberede så mange ARP eller MARP bibliotek plader er nødvendige for kun at dereplicate to til tre dereplication plader pr bibliotek plade. Når du er færdig, sætte en ny steril aluminium forsegling på den frosne skabelon og returnere den til minus 80 grader Celsius fryser.

Placer de podede 96-brøndplader inde i en løst forseglet plastikpose og inkuberes ved 37 grader Celsius med rystelser ved 250 RPM i 18 timer. Fjern ARP- eller MARP-skabelonen fra kuvøsen, og sørg for, at der ikke er forurenende stoffer til stede ved at sammenligne pladen med ARP- eller MARP-skabelonkortet. Fjern dereplicationspladerne fra fire grader Celsius og lad det bringe sig i ækvivalens med stuetemperatur.

Hvis der er kondens, åbnes lågene, og der tørres ud i et sterilt miljø. Brug sterile pinning værktøjer, pin fra ARP eller MARP bibliotek plade på overfladen af MHB agar overlay af dereplication plader. Pas på ikke at gennembore agaren.

Lad skabeloninoculum tørre i tre til fem minutter. Placer de podede dereplicationsplader på hovedet i en forseglet plastikpose og inkuberes natten over ved 37 grader Celsius. Den følgende dag, analysere dereplication resultater ved at sammenligne vækst på dereplication plade til brønde, der svarer til ARP eller MARP kort.

I denne ARP- eller MARP-dereplicationsarbejdsgang blev der opnået et positivt dereplicationsresultat. Hvor ekstraktet til stammen WAC 8921 blev identificeret som en chloramphenicolproducent. Manglen på ARP vækst indikerer tilstedeværelsen af enten en ukendt antibiotikum eller en mindre almindeligt forekommende antibiotikum, der ikke blev tegnede sig for i ARP eller MARP bibliotek plade.

Et vækstmønster, der er unikt for MARP, blev dannet på grund af dets udnyttelse af både vildtype E.coli BW25113 og en hyperpermeabel og e-flux-mangelfuld mutant E.coli BW25113 bamB tolC. Dette resultat tyder på tilstedeværelsen af et stof med antimikrobiel aktivitet, der ikke var i stand til at overgå en intakt ydre membran. Denne E.coli vækstmønstre tyder på forkert sterilisering af pinning værktøjer, resulterer i overførsel af ukendte E.coli stammer på tværs af overlay.

Og et eksempel på ARP eller MARP frosne lager bibliotek plade forurening er vist her med tre forskellige E.coli kolonier dyrket på den rektangulære Petriskål overflade. Dette resultat indikerer, at agaroverlejringen blev gennemboret under dereplication. MHB-overlejringsrelateret kontaminering kan også forekomme under dereplicationsprocessen, hvilket viser et uregelmæssigt vækstmønster på overfladen af overlejringen.

Det vigtigste at huske, når du følger denne protokol er at bruge korrekt sterilisation og aseptiske teknikker for at sikre, at du ikke holdes tilbage i noget trin på grund af forurening. Dette omfatter forberedelse af nitrocellulosemembranen, så den passer til overfladen af Bennetts agarplade så tæt som muligt for at minimere spredningen af sporer, når MHB-overlejringen hældes. Derudover er det også yderst vigtigt at bruge korrekt steriliseret pinning udstyr, når inoculating biblioteket plader og dereplicating for at producere det reneste resultat.

Ud over at dereplicere kendte antibiotika, denne metode kan anvendes til at identificere adjuvanser, som kan bruges sammen med eksisterende antibiotika til at redde deres aktivitet. Selv om antibiotika hånligbehandling ikke er en ny teknik, det er berygtet for at være ressourcekrævende og tidskrævende. ARP- og MARP-platformen er med til at kaste lys over, hvordan antibiotikaderup ikke behøver at være en stor produktion, men snarere kan gennemføres over en periode på to uger ved hjælp af minimalt udstyr.

X

Simple Hit Counter