Medicine
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Identificering af hæmmere af HBx-DDB1-interaktionen ved hjælp af et split luciferase-analyse system
Chapters
Summary December 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en metode til screening anti-hepatitis B viral agenter, der hæmmer HBX-DDB1 interaktion ved hjælp af en split der assay system. Dette system giver mulighed for nem påvisning af protein-protein interaktioner og er egnet til at identificere hæmmere af sådanne interaktioner.
Transcript
HBX-DDB1-interaktionen er et afgørende skridt til at fremme HPV-transskription fra cccDNA, så denne protokol kan blive et vigtigt aktiv for at opdage nye terapeutiske midler til HPV-funktionær. Vores procedure er enkel og kræver kun kort tid til at screene. Den interaktion, som jeg blander, kan detekteres i realtid uden at kræve cellelysis.
Desuden er screeningkvaliteten tilfredsstillende med en høj Z-prime score. Hæmning af HBX-DDB1 interaktion fører til restaurering af Smc5/6, hvilket resulterer i undertrykkelse af HPV transskription, protein udtryk, og cccDNA produktion. Denne nye mekanisme for antiviral handling kan overvinde manglerne ved de nuværende HPV-behandlinger.
Protein-protein interaktioner er vigtige klasse af narkotika mål. Den split-luciferase-baserede syre beskrevet her, som er rettet mod samspillet mellem viral og hasS proteiner, kan give en ny strategi for at udvikle helbredelsesmetoder for andre smitsomme sygdomme. Selvom vores protokol er enkel og let at forstå, kan nogle trin være svære at reproducere uden den visuelle demonstration.
Således vil den visuelle demonstration være en stor hjælp til at forstå vores protokol. Begynd med at så fem gange 10 til 5th HEK293T celler i en 100 millimeter skål med 10 milliliter DMEM, og inkubere dem natten over ved 37 grader celsius. Den næste dag fortyndes et mikrogram hver af HBx-LgBit og SmBit-DDB1, der udtrykker DNA-plasmider og DNA-kondensbuffer for et samlet volumen på 300 mikroliter.
Tilføj 16 mikroliter af forstærker opløsning, og bland rørene ved vortexing i et sekund. Prøven inkuberes ved stuetemperatur i tre minutter, og der tilsættes derefter 60 mikroliter refektionsreage. Vortex røret i 10 sekunder, og inkuber prøven i yderligere otte minutter.
I mellemtiden aspirere mediet fra skålen med cellerne og vask dem med fem milliliter PVS. Aspirere PVS og tilsæt syv milliliter DMEM. Tilføj tre milliliter DMEM til røret med transfektionskomplekser, pipette op og ned for at blande, og tilsæt blandingen til cellerne.
Derefter inkuberes cellerne ved 37 grader celsius og fem procent kuldioxid i 10 timer. Efter inkubationen fjernes brugt kulturmedium og cellerne vaskes med fem milliliter PVS. Fjern PVS på en milliliter på 0,25% trypsin EDTA, og inkuber cellerne ved 37 grader celsius for at frigøre dem.
Dernæst tilsættes fire milliliter DMEM, og sprede mediet ved pipettering det over overfladen af cellelaget flere gange, og overføre suspensionen til et rør. Centrifuge cellerne ved 500 gange G i fem minutter, derefter kassere supernatant, og re-suspendere cellen pellet i en milliliter PVS. Gentag cetrifugeationen, og kassér supernatanten.
Derefter re-suspendere celle pellet med buffercellekultur medium suppleret med 10% FBS til en såning tæthed på en million celler pr milliliter. Pipette 50 mikroliter af cellesuspensionen i hver brønd af en 96-brøndplade, og returnere cellerne til 37-graders-celsius-inkubatoren i 10 timer. Mens cellerne inkuberes, fortyndes screeningforbindelserne og opløsningsmidlet til 13,5 X koncentration.
Tilsæt 12,5 mikroliter af selvlysende substrat til hver brønd, og inkuber pladen i fem minutter ved stuetemperatur. Mål baseline luminescens med et luminometer, og tilsæt fem mikroliter af forbindelserne og kontrolleret DMSO til hver godt umiddelbart efter. Mål luminescens hver 30 minutter i to timer, derefter beregne hæmmende virkninger af forbindelserne i forhold til DMSO behandling.
Baseline luminescenssignaler blev målt, og signal-til-baggrund-forholdet blev beregnet til at være større end 80. Z prime var større end 0,5, hvilket indikerer, at dette analysesystem er acceptabelt for screening med høj kapacitet. Ved at fastsætte tærsklen til større end 40% hæmning i forhold til DMSO-only kontrol, nitazoxanid blev identificeret som en kandidat stof.
Vi har tidligere identificeret nitazoxanide som en hæmmer af HBX-DDB1 interaktion ved at screene en reaktivitet lille sammensatte bibliotek med denne metode. Ved hjælp af nitazoxanid bekræfter vi, at hæmning af HBX-DDB1-interaktionen, denne reduktion af viral transskription og efterfølgende virale produktniveauer. Den optimale del af den opdelte luciferase, der er smeltet til et målprotein, skal bestemmes på forhånd.
I dette tilfælde smeltede HPX til Large Bit ved C-endestationen HPX og DDB1, der smeltede til Small Bit ved slutperioden for DDB1, gav de bedste resultater.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
