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Combinando dispositivos fluidos com microscopia e citometria de fluxo para estudar transporte microbiano em mídia porosa em escalas espaciais
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Summary November 25th, 2020
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Curvas inovadoras (BTCs) são ferramentas eficientes para estudar o transporte de bactérias em mídia porosa. Aqui introduzimos ferramentas baseadas em dispositivos fluidos em combinação com microscopia e contagem citométrica de fluxo para obter BTCs.
Transcript
Estudar o transporte de bactérias em sistemas porosos é importante no que diz respeito à contaminação, disseminação de doenças e bioremediação. Para esses experimentos em modelos matemáticos que operam em uma única célula, a população e o nível da comunidade microbiana são necessários. Aqui apresentamos ferramentas para estudar o transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluidos e microscopia, bem como dispositivos maiores em combinação com citometria de fluxo.
A combinação de dispositivos microfluidos com microscopia e citometria de fluxo oferece uma gama de possibilidades para estudar fenômenos de transporte bacteriano em diferentes escalas espaciais. Para explorar plenamente este protocolo, sugere-se ter experiência prévia em microscopia, processamento básico de imagens, concepção de dispositivos microfluidos e citometria de fluxo. Este vídeo descreve dois métodos para estudar o transporte bacteriano em diferentes escalas espaciais.
O primeiro método, baseado em dispositivos microfluidos, depende de microscopia para contar células individuais. Este sistema pode ser usado para estudar o transporte bacteriano em múltiplas escalas espaciais desde o poro até toda a escala do sistema poroso. O segundo método, utilizando dispositivos fluidos maiores acoplados a um dispensador automatizado e citometria de fluxo, pode ser usado para estudar fenômenos de transporte bacteriano na escala de sistemas porosos inteiros.
Tais métodos também podem ser implantados em estudos de colunas em escala laboratorial, bem como em pequenos inquéritos de campo. Para começar, projete a geometria porosa desejada que consiste em uma matriz de círculos. Com base na geometria escolhida, prepare um molde usando fotolitografia SU-8 padrão.
Prepare 50 gramas de PDMS adicionando 90% de elastômero a 10% do agente de cura a 90% de elastômero em peso em um recipiente descartável limpo e misture os dois reagentes com uma ferramenta limpa. Aplique um vácuo de 100 milibar por 30 minutos para remover ar e bolhas dissolvidos. Coloque o molde em uma placa de Petri e despeje o PDMS sobre o molde até a altura desejada entre dois e cinco milímetros.
Cubra a placa de Petri com uma tampa e mantenha-a a 60 graus Celsius por pelo menos quatro horas. Depois disso, deixe o dispositivo microfluido esfriar à temperatura ambiente. Uma vez esfriado, remova cuidadosamente a porção desejada de PDMS com um bisturi.
Veda temporariamente a parte inferior do canal PDMS com fita. Com um perfurador de 0,5 milímetros de diâmetro, perfure os canais para criar uma entrada e uma tomada. Remova a fita do canal PDMS e coloque o canal com o lado poroso voltado para cima.
Trate o escorregador de vidro e as superfícies PDMS com plasma por cerca de 45 segundos cada um em temperatura ambiente. Coloque o canal PDMS pré-tratado no deslizamento de vidro pré-tratado e aqueça a 100 graus Celsius por 30 minutos em uma placa quente, depois remova o dispositivo microfluido da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente. Aplique o vácuo por 30 minutos para remover o ar do PDMS.
Para produzir a base contendo o compartimento de poros, use micro fresagem de alta precisão para remover 0,5 milímetros da camada base pmma e moer uma ranhura do tamanho de 1,1 por 1,1 milímetros para um anel O de borracha. Faça dois orifícios roscados para uma entrada e saída na parte superior do dispositivo fluido e 12 orifícios para parafusos. Isso serve como a tampa do dispositivo fluido.
Depois de limpar o dispositivo fluido, aparar a base e a tampa juntos usando os 12 orifícios roscados. Remova o microfluido do vácuo e coloque-o no estágio do microscópio. Use a bomba de seringa para saturar com tampão de motilidade.
Usando microscopia brightfield ou contraste de fase, ajuste a ampliação para visualizar células bacterianas individuais e foque no centro do canal de observação. Mude as configurações do caminho da luz para microscopia de fluorescência. Ajuste o foco através de um deslocamento e o tempo de exposição da câmera para resolver células bacterianas individuais.
Neste caso, 100 milissegundos. Em seguida, insira a tubulação de entrada em um tubo de dois mililitros contendo a suspensão bacteriana. Inverta a direção da bomba e comece a retirar a suspensão a uma taxa de fluxo de um microliter por minuto.
Escaneie a seção transversal de todo o canal de observação, gravando uma imagem a cada minuto. Importe imagens para uma plataforma de software desejada. Regisso plano de fundo como a média das primeiras imagens quando nenhuma partícula foi registrada.
Subtraia o fundo de cada imagem para remover o ruído da câmera e a aberração óptica. Corte as imagens para uma região de interesse. Identifique um valor limiar igual à intensidade do pixel da fluorescência celular de modo que valores maiores que o limiar incluem células bacterianas.
Use o processamento de imagem para subtrair o valor limiar de cada imagem. Binarize a imagem resultante para que as células bacterianas tenham um valor de um, enquanto o fundo tem um valor de zero. Remova clusters de pixels com uma área menor do que o menor tamanho de célula bacteriana em pixels.
Soma a imagem binarizada para obter o número total de pixels dos clusters restantes. Divida o número de pixels pelo tamanho médio de uma célula bacteriana em pixels para obter uma estimativa do número de células. Transforme as contagens em concentração em partículas por mililitro.
Para identificar a concentração da suspensão bacteriana injetada, injete a suspensão bacteriana no canal de observação de um dispositivo microfluido limpo com uma seringa. Registre a imagem e calcule a concentração bacterianafluente como mostrado anteriormente. Visualize curvas inovadoras normalizando a concentração bacteriana de efluentes C com a concentração bacterianafluente influente C0 e plotando C sobre C0 versus tempo.
Para analisar as velocidades locais e trajetórias de bactérias transportadas através da matriz porosa, mova o estágio do microscópio para uma região de interesse e ajuste o foco para o centro do dispositivo microfluido. Defina a configuração óptica como contraste de fase ou microscopia de fluorescência. Registo de tempo e tempo de exposição curto o suficiente para capturar deslocamento bacteriano.
Neste caso, 50 milissegundos. Grave imagens ao longo de um tempo suficiente, por exemplo, três minutos. Para remover o ruído de cada imagem, subtraia o fundo, que é a média da soma de todas as imagens gravadas.
Determine o módulo do gradiente numérico e normalize-o pelo seu valor máximo. Encontre e regisse coordenadas bacterianas e o tempo de aquisição de imagens em um arquivo de três colunas. Realizar análises de rastreamento de partículas para processar os dados registrados e calcular as trajetórias.
Para obter perfis de depoimento, registos uma imagem composta de todo o canal poroso antes, que é o fundo, e após a injeção da suspensão bacteriana através do dispositivo microfluido. Remova o fundo das imagens gravadas após a injeção bacteriana. Calcule o perfil de deposição D como a soma do sinal de fluorescência bacteriana ao longo de seções transversais de comprimento x do canal poroso.
Visualize o perfil de depoimento como o sinal de fluorescência local versus o comprimento do canal poroso. Para configurar o dispensador automatizado, coloque o dispensador robótico perto do dispositivo fluido. Conecte o dispensador robótico ao computador que executa o BCNC e identifique a porta com correta.
Em BCNC, clique no botão home para retornar o dispensador robótico à posição de casa. Conecte a bomba peristáltica com a entrada usando tubos de 50 centímetros de comprimento, um milímetro de diâmetro interno, e o fluxo de saída com o dispensador automatizado usando o mesmo tubo. Bombear meio de cultivo através do dispositivo fluido.
Observe a chegada do meio na tubulação de saída fixada ao dispensador robótico e coloque uma placa de 96 poços que coletará o fluxo de saída. Ao mesmo tempo, ative o dispensador robótico e injete a suspensão bacteriana através do dispositivo fluido PMMA a uma taxa de fluxo de 0,2 mililitros por minuto. Injete suspensão bacteriana equivalente a vários volumes de poros.
Por exemplo, 30 vezes o volume do dispositivo fluido. Após a injeção, mude para meio de cultivo estéril até o final do experimento. Uma vez que uma placa de 96 poços seja concluída, cubra a placa e armazene a quatro graus Celsius até a análise da citometria de fluxo.
Analise amostras com citometria de fluxo e visualize curvas inovadoras normalizando a concentração bacteriana de efluente C com a concentração bacterianafluente influente C0 e plotando C sobre C0 versus tempo. Neste estudo, utilizando-se tanto o motile quanto o pseudomonas putida KT2440, foram realizados experimentos sequenciais em dispositivos microfluidos PDMS com uma matriz aleatória de pilares. Curvas inovadoras normalizadas para a concentração de células injetadas, bem como trajetórias bacterianas na escala de poros são mostradas aqui.
Também foram realizados experimentos com dispositivos fluidos de larga escala moídos a partir de PMMA. Motile e pseudomonas não motile putida KT2440 foram injetados em uma matriz porosa regularmente espaçada. Surpreendentemente, em um ambiente poroso desprovido de biofilme, motile e pseudomonas não motile putida KT2440 mostrou um comportamento de transporte notavelmente diferente baseado em curvas inovadoras.
Em uma matriz porosa colonizada por 48 horas com uma complexa comunidade de biofilmes de fluxo, essas diferenças em curvas inovadoras entre motile e pseudomonas não motile putida KT2440 desapareceram. Usamos esse sistema para estudar o transporte bacteriano nos córregos, mas essas ferramentas podem ser prontamente ajustadas para estudar fenômenos de transporte bacteriano em outros sistemas projetados e ambientais. O transporte bacteriano através de meios porosos hidratados encapsula processos em múltiplas escalas espaciais.
A metodologia aqui apresentada permite ligar o deslocamento local de bactérias na escala de poros ao transporte microscópico em todo o meio poroso.
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