Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Verrijking van zoogdierweefsels en Xenopus-eicyten met cholesterol
Chapters
Summary March 25th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Twee methoden van cholesterolverrijking worden gepresenteerd: de toepassing van cyclodextrine verzadigd met cholesterol om zoogdierweefsels en -cellen te verrijken, en het gebruik van met cholesterol verrijkte fosforlipidengebaseerde dispersies (liposomen) om Xenopus-eocyten te verrijken. Deze methoden zijn instrumenteel voor het bepalen van de impact van verhoogde cholesterolniveaus in moleculaire, cellulaire en orgaanfunctie.
Transcript
Verhoogde cholesterol is een belangrijke risicofactor voor cardiovasculaire en neurodegeneratieve ziekte. Onze protocollen bieden waardevolle instrumenten voor het bestuderen van zowel fysiologische als mechanistische gevolgen van hypercholesterolemie. Deze procedures kunnen worden uitgevoerd met behulp van basislabapparatuur en zijn van toepassing op cellen, weefsels en Xenopus-eicellen.
Cholesterol is een belangrijk onderdeel van cellulaire membranen door het hele lichaam. Deze technieken kunnen worden gebruikt om de impact van verhoogde niveaus van cholesterol in elk celtype te bestuderen. Ontleden van de slagaders is de moeilijkste stap.
Verwijder de slagader voorzichtig uit de hersenen, zonder het vaatweefsel uit te rekken of te beschadigen. Lipiden zijn zeer delicaat, en werken met hen is meer een kunst dan een wetenschap. Video demonstratie biedt een gids voor het leren hoe om te gaan met lipiden zorgvuldig.
Om de cholesterolverzadigde methyyl-bèta-cyclodextrine-oplossing voor te bereiden, voegt u eerst 064 gram methyle-bèta-cyclodextrine toe aan 10 milliliter PBS, waarbij de oplossing wordt geroerd met een roerstaaf, om ervoor te zorgen dat het methyl-bèta-cyclodextrine volledig oplost. Voeg vervolgens 0024 gram cholesterolpoeder toe aan de kolf en roer de oplossing krachtig door, met behulp van een spatel om zoveel mogelijk cholesterolbrokken te breken. Wanneer bijna alle cholesterol is opgelost, verzegel de kolf met ten minste twee lagen paraffinefilm.
En schud de fles op ongeveer 30 oscillaties per minuut in een 37 graden Celsius waterbad 's nachts. Na acht tot 16 uur koelt u de oplossing af op kamertemperatuur, voordat u het mengsel door een 22 micrometer polyethersulfonespuitfilter in een klassefles filtert. Voor zoogdier cerebrale slagader verrijking, oogst de hersenen van een 250 tot 300 gram Sprague Dawley rat in een beker van PBS op ijs, voordat de overdracht van de hersenen in een gewaxte dissectie kom, onder een ontleden microscoop, met net genoeg PBS om het weefsel te dompelen.
Zet de hersenen met twee tot drie pinnen vast en zorg ervoor dat ze geen bloedvaten binnendringen. En gebruik scherpe tangen en kleine chirurgische schaar om zachtjes ontleden de cerebrale slagaders en hun takken die de cirkel van Willis vormen aan de basis van de hersenen. Spoel vervolgens kort tot een centimeter lange slagadersegmenten in PBS, voordat u de gespoelde segmenten in voldoende cholesterolverrijktoplossing uitbroedt om de weefsels te bedekken.
Om eventuele veranderingen in het cholesterolgehalte te bepalen, gebruik maken van een verse fles filipin poeder om een 10 milligram per milliliter voorraad oplossing van de kleurstof in dimethyl sulfoxide voor te bereiden, en was het cholesterolverrijkte weefsels met drie vijf minuten wasbeurten in verse PBS. Na de laatste wasbeurt, bevestig de slagader segmenten in 4%paraformaldehyde gedurende 15 minuten op ijs, beschermd tegen licht, voordat permeabilizing de monsters in 5%Triton in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de weefsels met drie vijf minuten wast in PBS op een shaker, alvorens de monsters toe te voegen aan een 25 microgram per milliliter uiteindelijke concentratie van filipin kleurstof oplossing, gedurende een uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
Aan het einde van de incubatie, was de slagader stukken drie keer zoals aangetoond, gevolgd door een korte spoeling met gedestilleerd water. Na de laatste wasbeurt, gebruik maken van een lab weefsel om overtollige vloeistof te absorberen, en monteer de slagaders op een dia met behulp van een geschikte montage medium. Bedek de slagaders voorzichtig met een afdeksel, zorg ervoor dat het weefsel niet wordt gerold of gedraaid, en laat de glijbaan 24 uur drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
Wanneer het montagemedium droog is, sluit u de randen van de afdekking af met heldere nagellak en laat u de polijst 10 tot 15 minuten drogen. Beeld vervolgens het weefsel met een excitatie van 340 tot 380 nanometer en een emissie van 385 tot 470 nanometer. Voor de voorbereiding van de fosfor op basis van dispersie, combineren 200 microliters van 10 milligram per milliliter chloroform opgelostlipide oplossing, L-alpha-fosfatidylethanolamine, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, en cholesterol in een 12 milliliter glazen buis.
Verdamp de chloroform in de kap onder een stroom stikstof, voordat u de lipiden opschont in 800 microliter van gebufferde 150 millimolar kaliumchloride en 10 millimolar Tris HEPES oplossing. Sluit vervolgens de buis af met paraffinefilm en sonisch de buisinhoud op 80 kilohertz gedurende 10 minuten, totdat een melkachtig mengsel wordt gevormd. Voor cholesterolverrijking van Xenopus eicellen, gebruik scherpe tangen om de eierstokzak van een vrouwelijke Xenopus laevis kikker in meerdere regio's te verstoren, en plaats de eierstok brokken in een 60 millimeter plaat met vijf milliliter calcium vrije ND96 aangevuld met 5 milligram per milliliter collagenase.
Schud het weefsel op een orbitale shaker met 60 oscillaties per minuut gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik aan het einde van de incubatie een transferpipet met een brede tip om de eiceloplossing vijf tot 10 keer krachtig te pipetteen om de afzonderlijke eicellen te isoleren en spoel snel de donkere eiceloplossing af met verse calciumvrije ND96 totdat de oplossing transparant wordt. Breng vervolgens 90 microliters van de cholesterolverrijkte fosfor op basis van dispersie over in een put van een 96-putplaat en voeg maximaal zes eicellen toe aan de put met zo weinig mogelijk medium.
Plaats de 96 put plaat op een driedimensionaal platform rotator voor vijf tot 10 minuten. Voeg vervolgens een druppel ND96 toe aan de put en breng de cholesterolverrijkte eicellen over naar een 35 millimeter plaat met ND96 voor hun onmiddellijke analyse. Hier, een voorbeeld van een afgebeelde cerebrale slagader gladde spierlaag toont de concentratie afhankelijke toename van filipin geassocieerde fluorescentie verkregen bij weefselverrijking met toenemende concentraties van cholesterol.
Met name drie uur na de behandeling met het methyyl-bèta-cyclodextrine cholesterolcomplex daalde het cholesterolgehalte met ongeveer 50% ten opzichte van hun niveau onmiddellijk na de verrijking. Terwijl een een uur incubatietijd wordt vaak gebruikt om de weefsels en cellen te verrijken met cholesterol tijdens deze aanpak, vijf minuten van incubatie is meestal voldoende om een statistisch significante toename van cerebrale arteriële cholesterolgehalte zoals bepaald door cholesterol oxidase gebaseerd biochemische test te bereiken. Terwijl er geen significante verandering wordt waargenomen in het cholesterolgehalte in Xenopus eicellen verrijkt met controle fosfolipiden gebaseerde dispersies zonder cholesterol, cholesterolgehalte aanzienlijk toenemen na slechts vijf minuten van de behandeling met de fosfolipiden op basis van dispersies die cholesterol omvatten, en blijven op dit niveau wanneer de incubatietijd wordt verhoogd tot 60 minuten.
De effectiviteit van de cyclodextrine gebaseerde aanpak voor het verrijken van cellen wordt ook aangetoond in neuronen vers geïsoleerd uit de CA1 regio van de hippocampus. Inderdaad, incubatie van de neuronen in methyl-bèta-cyclodextrine verzadigd met cholesterol gedurende 60 minuten resulteert in een meer dan twee keer toename van het cholesterolgehalte, zoals beoordeeld door de filipin geassocieerde fluorescentie. Globaal, zijn de twee belangrijkste stappen voor deze procedures het voorbereiden van het mengsel van de cholesterolverrijking en het verzekeren van de integriteit van het arteriële weefsel.
Na cholesterolverrijking kan men de functie bestuderen van de eiwitten die worden beïnvloed door hypercholesterolemie. De mogelijkheid om cellen te verrijken met cholesterol vergemakkelijkt de studie van verhoogde cholesterolniveaus in cardiomyocyten en neuronen. Het gebruik van eicellen stelde ons in staat om te onderzoeken hoe cholesterol zich bindt aan ionenkanalen.
Een lab jas en handschoenen ze altijd worden gedragen voor dit protocol. Chloroform en paraformaldehyde moeten onder een rookkap worden gebruikt en als gevaarlijk afval worden weggegooid.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
