Journal
/
/
Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden
JoVE Journal
Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biochemistry
Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden

1,742 Views

07:21 min

November 17, 2023

DOI:

07:21 min
November 17, 2023

20 Views
,

Transcript

Automatically generated

Ons nieuwe protocol helpt bij het onderscheiden en kwantificeren van drie statussen van buisringen, zoals stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuli in dierlijke weefsels. Deze techniek bestaat uit eenvoudige stappen en kan de structurele stabiliteit van slangen evalueren, die niet kan worden gedetecteerd door kwantificering van slangen na translationele modificatie. Deze methode is essentieel voor het onderzoek naar en de ontwikkeling van therapeutische manieren voor ziekten waarbij de stabiliteit van microtubuli van cruciaal belang is, zoals de ziekte van Alzheimer en kanker.

Start de procedure door de laboratoriumkleding voor te bereiden op weefseldissectie. Vul een doos met crushed ice en plaats er twee petrischaaltjes op. Vul een schaal met ijskoude fosfaatbufferoplossing of PBS voor voorbijgaande wassing en opslag van ontlede weefsels.

Leg het met PBS bevochtigde filtreerpapier op de tweede schaal. Weeg vervolgens de microbuisjes van 1,5 milliliter gevuld met PBS voor de opslag van ontleed weefsel. Nadat u de weefsels uit een geëuthanaseerde muis hebt geëxtraheerd, brengt u ze over naar de buisjes en weegt u elke microbuis opnieuw.

Verplaats de weefsels in een glazen homogenisator met ijskoude microtubuli-stabiliserende buffer of MSB+medium, en homogeniseer het weefsel onmiddellijk met behulp van een gekoelde homogenisator. Breng nu het weefselhomogenaat over in een microbuis van twee milliliter met behulp van een pasteurpipet en centrifugeer gedurende drie minuten bij twee graden Celsius bij 2.400 G. Breng het supernatans over in een nieuwe microbuis van 1.5 milliliter om het vuil te verwijderen.

Vortex het supernatans of de S1-fractie in een nieuwe microbuis van 1,5 milliliter. Pipetteer onmiddellijk 200 microliter van de S1-fractie in een centrifugatiemicrobuisje en centrifugeer bij 100.000 G met behulp van een TLA-55-rotor gedurende 20 minuten bij twee graden Celsius. Scheid na de tweede centrifugatie het S2-supernatans van het P2-neerslag.

Breng onmiddellijk de volledige hoeveelheid van de S2-fractie over in een centrifugatiemicrobuis en gebruik een TLA-120.2-rotor om deze gedurende 60 minuten bij twee graden Celsius op 500.000 G te laten draaien. Scheid na de derde centrifugatie het S3-supernatans van het P3-neerslag. Los de volledige S3-fractie op in 200 microliter 2X natriumdodecylsulfaat of SDS-monsterbuffer.

Meng de resterende S1-fracties met een gelijk volume van 2X SDS-monsterbuffer voor gebruik als standaardcurve voor western blotting. Voeg vervolgens 400 microliter SDS-monsterbuffer toe aan de P2- en P3-fractiebuisjes. Sonificeer vervolgens kort de oplossing om het neerslag op te lossen voordat u de monsters overbrengt in nieuwe microbuisjes van 1.5 milliliter en ze in de koelbox plaatst.

Kook alle monsters gedurende drie minuten op 100 graden Celsius. Microtubuli in de P2-fractie waren goed voor 34,86% van de totale alfa-tubuline in een muizenbrein, terwijl die in de P3- en S3-fracties respectievelijk 56,13% en 9,01% voor hun rekening namen. Het percentage bèta-3-tubuline in de P2-, P3- en S3-fracties verschilde niet significant van dat van alfa-tubuline.

De S2-fractie vertoonde een beperkte doorgang van tubuline door een 300-kilodalton ultrafiltratie-spinkolom, terwijl de S3-fractie volledige doorgang van tubulinecomplexen mogelijk maakte. Chromatografische scheiding resulteerde in een 100-kilodalton elutie van S3-tubuline. In elke fractie werden gelijke hoeveelheden alfa- en bètatubuline teruggevonden.

P2-fracties waren significant verrijkt met geacetyleerde alfa-tubuline, terwijl tyrosinated alfa-tubuline dominant was in de P3-fractie. Het bevriezen van de hersenen voorafgaand aan homogenisatie resulteerde in een verlaagde alfa-tubulineconcentratie in de P2-fracties. Alfa-tubuline nam echter toe in de P3-fractie.

Bevriezing verlaagde ook de acetyleringsniveaus en verhoogde de tyrosinatieniveaus van alfa-tubuline in de P2-fractie. Behandeling met nocodazol verlaagde alfa-tubuline in de P2-fractie. In tegenstelling tot bevriezing had nocodazol geen invloed op de posttranslationele modificaties van P2-tubuline.

Het hersenweefsel vertoonde een significant hogere concentratie P2-tubulinen, terwijl P3-tubulines geconcentreerd waren in proliferatief weefsel. Western blotting toonde aan dat de P2-tubuline die specifiek in het zenuwstelsel wordt aangetroffen, afkomstig is van stabiele microtubuli en P3-tubuline afkomstig is van labiele microtubuli. De stabiliteit van microtubuli is zeer dynamisch.

Het is belangrijk om dit protocol snel, zonder onderbrekingen, te voltooien in een omgeving met koude temperaturen. Zorg er ook voor dat de weefsels en fracties niet zijn ingevroren totdat ze zijn opgelost in de SDS-monsterbuffer. Het combineren van immuunpresentatie met behulp van elke fractie met proteomics zal naar verwachting factoren identificeren die betrokken zijn bij de dynamiek van microtubuli.

Met behulp van deze methode hebben we onthuld hoe normaal tau bestaat op microtubuli. Het kan ook worden gebruikt om te bestuderen hoe het abnormaal wordt in verouderde hersenen om nieuwe medicijndoelen van dementie te identificeren.

Summary

Automatically generated

Microtubuli, die tubulinepolymeren zijn, spelen een cruciale rol als onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen en staan bekend om hun dynamische instabiliteit. Deze studie ontwikkelde een methode voor het fractioneren van microtubuli om ze te scheiden in stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline om de stabiliteit van microtubuli in verschillende muizenweefsels te evalueren.

Read Article