Langdistanse Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging av dårligere colliculus nevroner med blå og rød-forskjøvet channelrhodopsins

Channelrhodopsin-assistert kretskartlegging er en presisjonsteknikk for funksjonell kartlegging av langtrekkende nevrale projeksjoner. Her viser vi hvordan du bruker denne tilnærmingen til å undersøke kretser i den hørbare hjernestammen. I hjerneskiver er aksoner fra flere kilder ofte blandet sammen, noe som gjør det vanskelig å isolere individuelle innganger ved hjelp av elektrisk stimulering.

Ved å bruke CRACM kan denne begrensningen overvinnes. Å finne lambda og konsekvent definere stereotoksisk koordinatsystem er utfordrende som holder varigheten av prosedyren kort. Å ha alle trinnene nøye kartlagt vil øke suksessraten.

Begynn med å sprøyte operasjonsområdet med 70% etanol for å rense og plassere sterile håndklegardiner for å dekke operasjonsområdet. Fjern bur sengetøy for å begrense risikoen for kvelning fra utvinning buret. Deretter legger du en varmepute under buret og gir en mat- og vannkilde.

Deretter overfører du dyret til en stereotoksisk ramme og fortsetter anestesi. Sett inn en rektal temperatursonde og slå på den homeostatiske temperaturregulatoren. Deretter påfør oftalmisk salve for å hindre at øynene tørker ut.

Administrer forebyggende smertestillende. Til slutt barberer du hodebunnen med elektriske klippere. Desinfiser hodebunnen med tre vekslende vattpinner av povidonjod og 70% etanol.

Begynn operasjonen ved å gjøre et snitt i hodebunnen langs midtlinjen, starter mellom ørene og fortsetter rostral til øynene, utsette lambda og bregma suturer. Skyv huden til siden og fjern periosteum fra det eksponerte beinet om nødvendig. Deretter markerer lambda sutur med en kirurgisk markør, plasser spissen av nanoinjektoren slik at den bare berører lambda og null mikromanipulatorkoordinatene.

Bruk nanoinjektorspissen og mikromanipulatoren til å måle forskjellen i høyde mellom lambda og bregma suturer. Juster palettbarhøyden for å bringe lambda og bregma til innenfor pluss eller minus 100 mikrometer høydeforskjell. Kartinjeksjonsstedet ved hjelp av nanoinjektorspissen og mikromanipulatorkoordinatsystemet og merk stedet med en kirurgisk markør.

Deretter bruker du en mikromotorbor med en 0,5 millimeter drillgrad for å utføre en kraniotomi over injeksjonsstedet. For å sikre bred transfection av nevroner i målkjernen, bruk en nanoinjektor for å gjøre injeksjoner på ulike dybder i vevet og i tilfelle av større hjerneregioner, som den dårligere colliculus, gjør injeksjoner i løpet av to eller flere penetrasjoner ved forskjellige X- og Y-koordinater. For å injisere den dårligere colliculus, avse 20 nanoliter virus i intervaller på 250 mikrometer langs Z-aksen mellom 2, 250 mikrometer og 1, 750 mikrometer dybde.

For injeksjoner i den dorsale cochleakjernen, avsug 20 nanoliter virus på henholdsvis 4, 750 mikrometer og 4550 mikrometer. Etter injeksjon ved hver Z-koordinat, vent to til tre minutter før du flytter injektoren til neste Z-koordinat for å gi viruset tid til å spre seg bort fra injeksjonsstedet, noe som reduserer sannsynligheten for at viruset vil bli sugd opp i injeksjonskanalen når nanoinjektoren flyttes. Deretter, etter den siste injeksjonen, vent tre til fem minutter før du trekker nanoinjektoren ut av hjernen.

Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellom penetrasjoner og mellom dyr, løs ut et lite virusvolum fra spissen for å kontrollere at spissen ikke er tilstoppet. Etter injeksjoner, bruk steril PBS for å riste de kuttede kantene av hodebunnen og deretter forsiktig flytte huden tilbake mot midtlinjen. Lukk såret med enkle avbrutte suturer ved hjelp av 6-0 nylonsuturer.

Deretter påfør 0,5 til en milliliter 2% lidokaingelé på såret. Fjern ørestangene og temperatursonden, vri isofluran, og fjern dyret fra palettstangen og overfør det til gjenopprettingsburet. Til slutt, overvåke utvinning nøye.

Når dyret er helt våken, beveger seg rundt, og viser ingen tegn på smerte eller nød, overføre den tilbake til buret og returnere buret til vivarium. Bruk standard patch clamp metoder for å gjøre opptak. Begynn med å plassere skiven i et opptakskammer under et fast stadium oppreist mikroskop og kontinuerlig rikelig med kunstig cerebrospinalvæske ved to milliliter per minutt.

Deretter lappe nevroner under visuell kontroll ved hjelp av en passende patch klemme forsterker. Til slutt, under engrosopptak, aktivere Chronos ved å levere korte pulser på 470 nanometer lys eller ChrimsonR ved korte pulser på 580 nanometer lys gjennom kommersielt tilgjengelige lysdioder. Resultatene indikerte at ChrimsonR injeksjon førte til sterkt uttrykk i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre.

I den kontralaterale ICC var fibrene som var sterkt merket med tdTomato godt synlige etter tre uker, noe som viste den langsiktige smuglingsevnen til ChrimsonR-tdTomato-konstruksjonen når de injiseres i auditive hjernestammekjerner. Optisk aktivering av ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP nevroner, noe som indikerer at ChrimsonR er et nyttig verktøy for langdistanse CRACM eksperimenter når eksperimentelle parametere krever bruk av rødt lys i stedet for blått lys. Vi fant imidlertid ut at ChrimsonR ble lett aktivert med blått lys, og viste samme terskel for aktivering av blått lys som Chronos.

For denne protokollen er det viktigst å sørge for at stereotoksiske koordinater er riktige og for å bekrefte at viruset ble uttrykt bare i din målrettede hjerneregion. Ved å utveksle Chronos ChrimsonR virokonstruksjon med et annet virus, for eksempel et cellespesifikt Flex-virus, kan du svare på flere anatomiske eller fysiologiske spørsmål uten å endre operasjonsprotokollen.