Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उच्च दक्षता उत्पादन के लिए फ्रीज-गल भ्रूण का उपयोग
Summary April 2nd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
यहां, हम एक कोशिका भ्रूण के क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ-साथ एक प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधित विधि पेश करते हैं जो आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की कुशल पीढ़ी के लिए फ्रीज-गल भ्रूण और इलेक्ट्रोपोराशन का उपयोग जोड़ता है।
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों को आसानी से, कुशलता से और तेजी से एकल कोशिका माउस भ्रूण से तैयार करने की सुविधा प्रदान करता है। हमारा प्रोटोकॉल फ्रीज-गल वन-सेल चरण भ्रूण और इलेक्ट्रोपाउशन के उपयोग को जोड़ता है जो उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों पर उत्परिवर्ती चूहों सहित आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की तेजी से पीढ़ी की अनुमति देता है। इन विट्रो निषेचन के लिए, गर्भवती घोड़ी सीरम गोंडोट्रोपिन की 7.5 अंतरराष्ट्रीय इकाइयों के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से चार या आठ सप्ताह पुरानी मादा C57BL/6J चूहों द्वारा शुरू करें और इसके बाद 48 घंटे बाद मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन की 7.5 अंतरराष्ट्रीय इकाइयों के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन का पालन किया गया।
इसके बाद, यौन परिपक्व तीन से पांच महीने पुराने पुरुष C57BL/6J चूहों से कौडा एपीडिडिमिस को हटा दें और शुक्राणुओं के थक्के निकालने के लिए एक विच्छेदन सुई का उपयोग करें । फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर एचटीएफ की 200 माइक्रोलीटर ड्रॉप में थक्के और क्षमता के लिए 1.5 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड को इनक्यूबेट करें। मानव कोरियोनिक गोंडोट्रोपिन इंजेक्शन के 16 से 18 घंटे बाद, ओविडक्ट्स से क्यूमुलस ओसाइट परिसरों को इकट्ठा करें और एचटीएफ के 200 माइक्रोलीटर के साथ परिसरों को इनक्यूबेट करें जो सेल कल्चर इनक्यूबेटर में दो घंटे से अधिक इनक्यूबेशन के लिए तरल पैराफिन से ढके हुए हैं।
इनक्यूबेशन के अंत में, इनक्यूबेशन माध्यम की सीमा से शुक्राणु निलंबन के एक से पांच माइक्रोलीटर को क्यूमुलस ओसाइट परिसरों की 200 माइक्रोलीटर ड्रॉप में जोड़ें और सह-संस्कृति को तीन घंटे के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, किसी भी शेष शुक्राणु और क्यूमुलस कोशिकाओं को हटाने के लिए पोटेशियम पूरक सिंप्लेक्स ऑप्टिमाइजेशन माध्यम के साथ ओसाइट्स को तीन बार धोएं और एक कोशिका भ्रूण के प्रोन्यूक्लियर गठन और ग्रेड की जांच करने के लिए एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक सेल भ्रूण क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, भ्रूण को एचटीएफ के एक ताजा 200 माइक्रोलीटर ड्रॉप में स्थानांतरित करें, जो सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 10 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक है।
इनक्यूबेशन के अंत में, एक मोलर डिमेथाइल सल्फोक्साइड समाधान के 50 माइक्रोलीटर को 20 से 100 भ्रूण स्थानांतरित करें और क्रायोट्यूब के नीचे समाधान के पांच माइक्रोलीटर में 100 भ्रूण तक स्थानांतरित करें। ट्यूब के किनारे नीचे DAP213 समाधान के ४५ माइक्रोलीटर जोड़ने से पहले शून्य डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए भ्रूण शांत । कैपिंग के बाद, कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में ट्यूब को जल्दी से संग्रहित करने से पहले शून्य डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त पांच मिनट के लिए रखें।
CRISPR आरएनए का एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर और कम सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम में ट्रेसरएनए का एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर तैयार करें। नाभिक मुक्त बफर के 42 माइक्रोलीटर के लिए प्रत्येक आरएनए समाधान के छह माइक्रोलीटर जोड़ें और मिश्रण को 95 डिग्री सेल्सियस पर तीन मिनट के लिए एक सूखे हीटर में रखें। इनक्यूबेशन के अंत में, मिश्रण को पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा करें और कम सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम के साथ HiFi Cas9 प्रोटीन का एक माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर तैयार करें।
आरएनए समाधान के लिए पतला HiFi Cas9 समाधान के छह माइक्रोलीटर जोड़ें और एक पूरे ग्लास स्लाइड में परिणामी रिबोन्यूक्लिकोप्रोटीन जटिल समाधान के 25 माइक्रोलीटर में 100 गल भ्रूण तक स्थानांतरित करें। फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए भ्रूण को इनक्यूबेट करें। भ्रूण इलेक्ट्रोपाउशन के लिए, इनक्यूबेशन के अंत में, इलेक्ट्रोपोरेटर पैरामीटर सेट करें और स्लाइड को इलेक्ट्रोपोरेटर पर लोड करें।
इलेक्ट्रोपाउशन भ्रूण विगलन के एक घंटे के भीतर किया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि जीनोम संपादन डीएनए की पहली प्रतिकृति से पहले और मोज़ेकवाद को रोकने के लिए होता है। इलेक्ट्रोपॉनेशन के बाद, भ्रूण को संशोधित क्रेब्स-रिंगर बाइकार्बोनेट बफर दो माध्यमों के साथ तीन बार धोएं, जिसमें तरल पैराफिन से ढके पोटेशियम पूरक सिंप्लेक्स ऑप्टिमाइजेशन माध्यम की एक बूंद है। फिर रात भर सेल कल्चर इनक्यूबेटर में ताजा पोटेशियम पूरक सिंप्लेक्स ऑप्टिमाइजेशन माध्यम में भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
एक सेल भ्रूण के लिए इस संशोधित क्रायोप्रिजर्वेशन विधि का उपयोग करने से फ्रीज-गल भ्रूण की विकासात्मक दर को दो-सेल चरण में सुधार होता है। इस विधि का उपयोग करके, इस प्रतिनिधि प्रयोग में उत्पन्न सभी चूहों को केवल एक मोज़ेक माउस के साथ सफेद और काले पैच के साथ कोट युक्त था। यहां एम1 एली युक्त एल्बिनो माउस से क्रोमोग्राम का एक प्रतिनिधि अनुभाग देखा जा सकता है।
जैसा कि सचित्र, प्रोटोकॉल उच्च दक्षता और कम मोज़ेक दरों के साथ नॉकआउट और नॉक-इन चूहों उत्पन्न कर सकता है। दरअसल, होमोज़िगस एफ 0 संतानों की F1 संतान विषम हैं जिसमें एक उत्परिवर्ती और एक जंगली प्रकार के एलील होते हैं जिसमें कोई अलग उत्परिवर्तन नहीं होता है। याद रखें कि निषेचित अंडा एक कोशिका चरण में नाजुक है।
भ्रूण गोजातीय सीरम के अलावा भ्रूण पुष्ट। हालांकि, इसे प्रत्येक चरण में सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए। यह विधि आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के तेजी से और अधिक कुशल उत्पादन को सुविधाजनक बनाकर मानव रोगों में जीन समारोह और अनुसंधान के विश्लेषण में योगदान दे सकती है।
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE