Bruk av frysetinte embryoer for høyeffektivitetsproduksjon av genmodifiserte mus

Vår protokoll forenkler utarbeidelsen av genmodifiserte mus enkelt, effektivt og raskt fra encellede museembryoer. Vår protokoll kombinerer bruk av fryse-tint en-celle stadium embryoer og elektroporasjon slik at rask generasjon av genmodifiserte mus inkludert mutant mus ved høy effektivitet og lav mosaikk priser. For in vitro befruktning, begynne med super eggløsning fire eller åtte uker gamle kvinnelige C57BL/6J mus via intraperitoneal injeksjon av 7,5 internasjonale enheter av gravid mare serum gonadotropin etterfulgt av intraperitoneal injeksjon av 7,5 internasjonale enheter av humant choriongonadotropin 48 timer senere.

Deretter fjerner cauda epididymis fra seksuelt modne tre til fem måneder gamle mannlige C57BL/6J mus og bruke en dissekering nål for å trekke ut blodpropper av spermatozoa. Deretter inkubere blodproppene i en 200 mikroliter dråpe HTF ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 1,5 timer for kapasitet. 16 til 18 timer etter human choriongonadotropin injeksjon, samle cumulus oocyte komplekser fra oviducts og inkubere kompleksene med 200 mikroliter av HTF dekket med flytende parafin for en ikke mer enn to timers inkubasjon i cellekulturinkubatoren.

På slutten av inkubasjonen legger du til en til fem mikroliter av spermsuspensjon fra grensen til inkubasjonsmediet til 200 mikroliterdråpe cumulus oocytekomplekser og plasserer co-kulturen i cellekulturinkubatoren i tre timer. På slutten av inkubasjonen, vask oocytter med kalium supplert simplex optimalisering medium tre ganger for å fjerne eventuelle gjenværende sperm og cumulus celler og bruke et omvendt mikroskop for å sjekke den pronukleære dannelsen og karakteren av en celle embryoer. For en celle embryo kryopreservation, overføre embryoene til en frisk 200 mikroliter dråpe HTF supplert med 20% fosterbovin serum for en 10-minutters inkubasjon i cellekulturinkubatoren.

På slutten av inkubasjonen overfører du 20 til 100 embryoer til 50 mikroliter av en molar dimetylsulfoksidoppløsning og overfører opptil 100 embryoer i fem mikroliter oppløsning til bunnen av et kryorør. Avkjøl embryoene i fem minutter ved null grader Celsius før du legger til 45 mikroliter DAP213-løsning nedover siden av røret. Etter capping, holde cellene i ytterligere fem minutter ved null grader Celsius før du raskt lagrer røret i flytende nitrogen.

Forbered ett mikrogram per mikroliter CRISPR RNA og ett mikrogram per mikroliter tracrRNA i redusert serum minimalt viktig medium. Tilsett seks mikroliter av hver RNA-løsning til 42 mikroliter kjernefri buffer og legg blandingen i en tørr varmeapparat i tre minutter ved 95 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen avkjøles blandingen ved romtemperatur i fem minutter og forbereder ett mikrogram per mikroliter hifi cas9-protein med redusert serum minimalt essensiell medium.

Tilsett seks mikroliter av den fortynnede HiFi Cas9-løsningen til RNA-løsningen og overfør opptil 100 tinte embryoer til 25 mikroliter av den resulterende ribonucleoprotein komplekse løsningen i en ett hel glasssklie. Deretter inkuber embryoer i 10 minutter ved 37 grader Celsius. For embryoelektroporasjon, på slutten av inkubasjonen, sett elektroporatorparametrene og last lysbildet på elektroporatoren.

Elektroporasjon bør utføres innen en time etter embryo tining for å sikre at genomredigering oppstår før den første replikering av DNA og for å hindre mosaikkisme. Etter elektroporasjonen, vask embryoene tre ganger med modifisert Krebs-Ringer bikarbonatbuffer to middels i to vasker med en dråpe kaliumsupplert simplex optimaliseringsmedium dekket med flytende parafin. Deretter inkubere embryoene i fersk kalium supplert simplex optimalisering medium i cellekultur inkubator over natten.

Ved hjelp av denne modifiserte kryopreservasjonsmetoden for encellede embryoer forbedrer utviklingshastigheten til frysetinede embryoer til tocellet stadium. Ved hjelp av denne metoden var alle de genererte musene i dette representative eksperimentet albino med bare en mosaikkmus som bærer en frakk med hvite og svarte flekker. Her kan en representativ del av et kromatogram fra en albinomus som inneholder M1-allelet observeres.

Som illustrert kan protokollen generere knockout og knock-in mus med høy effektivitet og lave mosaikkhastigheter. Faktisk er F1 avkom av homozygous F0 avkom heterozygous som inneholder en mutant og en vill type allele uten ulike mutasjoner. Husk at det befruktede egget er skjør på encellet stadium.

Tilsetning av fosterbovin serum forsterker embryoet. Det må imidlertid håndteres nøye på hvert trinn. Denne metoden kan bidra til analyse av genfunksjon og forskning på menneskelige sykdommer ved å legge til rette for en raskere og mer effektiv produksjon av genmodifiserte mus.