Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Laser-induceret hjerneskade i Motor Cortex af rotter
Chapters
Summary September 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollen præsenteres her viser en teknik til at skabe en gnaver model af hjerneskade. Den metode, der er beskrevet her bruger laserbestråling og mål motor cortex.
Transcript
Vores protokol giver en ny metode til at skabe traumatisk hjerneskade hos rotter ved hjælp af laserbestråling for at skabe fokus indvirkning i den motoriske cortex. Den største fordel ved denne teknik er den lave variation i infarkt område, den lave dødelighed, og den relative enkelhed af proceduren, som ikke kræver ekspert håndterer. Demonstration af proceduren vil være Dmitry Natanel, en forsker fra vores laboratorium.
At udføre en laser-induceret hjerneskade, først tildele 20, 300 til 350 gram Sprague Dawley rotter i laser-gruppen og 20 til kontrol Sham-opererede gruppe. Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tilbagetrækning refleks, placere en rotte på en rektal temperatur reguleret varmepude og bruge en barbermaskine til at fjerne nok hår fra skadesstedet med en cirka to centimeter hår-fri margin omkring snittet. Desinficere den eksponerede hud med 70% ethanol og placere rotten i den udsatte position i en stereotaxic hovedholder.
Lav en tre centimeter snit til at tillade lateral afspejling af hovedbunden til at eksponere området mellem bregma og lambda. Holding en Nd:YAG laser med peak bølgelængde af 1064 nanometer på en to millimeter afstand fra kraniet, administrere 50 joule gange 10 point med en et-sekund puls varighed til det udsatte område af kraniet over højre halvkugle. Efter laser skade er blevet leveret, fjerne rotten fra enheden og lukke hovedbunden med 3-0 silke kirurgiske suturer.
Derefter placere rotten i sit bur med overvågning, indtil fuld recumbency. 24 timer efter indgrebet skal du bruge et 43-punkts scoringssystem til at vurdere den neurologiske sværhedsgradsscore. Test af dyrene for neurologiske underskud, adfærdsforstyrrelser, stråle balancering opgave, og reflekser, og tildele højere score for mere alvorlige handicap.
Efter vurderingen høstes hjernen fra hvert forsøgs- og kontroldyr i henhold til standardprotokoller. For at vurdere hjernen infarkt volumen, afsnit de høstede hjerner i seks to millimeter tykke koronale skiver og inkubere hver skive i 0,05% TTC i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Efter farvning skal du scanne disse udsnit med en optisk scanner med en opløsning på 1600 med 1600 prikker pr. tomme.
De uhæmmede områder af de faste hjerneskiver defineres som infarkte. For at vurdere forekomsten af brud på blod-hjernebarrieren, 24 timer efter laserinduceret skade belastning en sprøjte med 2%Evans blå farvestof fortyndet i fire milliliter pr kg saltvand opløsning og levere opløsningen intravenøst til de sårede og kontrol rotter via den kanylede hale vene. Lad opløsningen cirkulere i en time, før du bruger kirurgiske pincets og saks til at åbne brystet af det første dyr.
Se det eksponerede hjerte med afkølet 0,9% saltvand via venstre hjertekammer ved 110 millimeter kviksølv af tryk, indtil en farveløs overflod væske er observeret fra højre atrium. Dernæst høste hjernen og få to millimeter rostral caudal skiver. Adskå venstre hjerne skiver fra højre hjerne skiver til at tillade evaluering af de sårede og ikke-sårede halvkugler separat, og afveje prøverne.
Prøverne homogeniseres ved hjælp af en morter og støder, og vævsprøverne inkuberes i 50%trichloreddikesyre i 24 timer. Den næste dag, centrifuge de homogeniserede hjernevæv prøver i 20 minutter ved 10, 000 gange G og stuetemperatur, og bland en milliliter af supernatant med 1,5 milliliter 96% ethanol ved en til tre forhold. Brug derefter en fluorescensdetektor ved en 620 nanometer excitation og 680 nanometer emissionsbølgelængden til at vurdere blod-hjernebarrieren brud.
Som observeret ved histologisk analyse, Evans blå farvning kan bruges til at afsløre forekomsten af hjerneskade på laser og MCAO model dyr. I denne repræsentative analyse blev der ikke registreret dødsfald eller subarafoide blødninger i hverken kontrol- eller forsøgsgrupperne, og MCAO-gruppen havde en 20% dødelighed og subarafoid blødning. De relative kropstemperaturændringer i rotterne fra begge grupper var også ens, på trods af en forskel i variabiliteten i begge grupper.
De neurologiske sværhedsgradsscorer var betydeligt værre i både laser- og MCAO-modellerne sammenlignet med den Sham-opererede kontrolgruppe. Laser-induceret til hjerneskade forårsagede også en betydelig stigning i infarkt volumen på målhalvhalsen i forhold til Sham-opererede kontrolgruppe. Lasermodellens infarkte volumen var imidlertid mindre sammenlignet med de dyr, der blev såret af MCAO-teknikken.
Der blev ikke observeret nogen forskel i hjerneødem mellem den laserinducerede hjerneskademodel og den Sham-opererede kontrolgruppe. Men, der var en betydelig forskel i hjernen ødem mellem laser model og MCAO sårede grupper. Sammenlignet med sham-opererede kontrolgruppe, laser-induceret hjerneskade og MCAO teknikker både forårsaget en betydelig stigning i blod-hjerne barrieren brud på de ikke-sårede og målhalvhals.
Mens du forsøger denne model, skal du huske præcist at målrette den motoriske cortex område og standardisere den energi, antallet af punkter, der bestråles, og den samlede redegørelse tid. Efter denne procedure, en bred overflod af adfærdsmæssige tests, såsom stråle gang, Froedert, og andre evalueringer kan udføres.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
