Genetics
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通过定量染色体形成捕获（4C）鉴定胚胎体增强剂-促进者接触
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Summary April 29th, 2020
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我们报告定量染色体构象捕获的应用，随后在胚胎干细胞生成的胚胎体中进行高通量测序。该技术允许在胚胎干细胞分化期间识别和定量特定基因的假定增强剂和启动器区域之间的接触。
Transcript
基因的精确时空调控由它们之间相互作用的不同 cis 调控元素控制。我们的协议使得定量地询问选定位点（如启动子）的染色质接触成为可能。这种技术使我们能够同时识别和量化各种调控元素之间的相互作用频率。
要产生胚胎体，首先将小鼠胚胎干细胞培养到60%的汇合。然后去除培养介质，然后用两毫升消毒的 PBS 洗涤两次。完全取出PBS，并添加两毫升的细胞分离介质。
在37摄氏度下孵育培养皿。孵育五分钟后，在盘中加入8毫升EB分化介质。为了分离MESC菌落以获得单细胞悬浮液，移液器的介质向上和向下15至20次，并转移悬浮到10毫升管。
在室温下以300倍g离心，5分钟。然后小心地取出上一液。计数细胞后，用EB分化介质重新暂停细胞颗粒。
倒置 15 厘米文化菜的盖子。使用200微升多通道移液器，将20微升的再增电池滴在盖子上。小心地倒置盖子，并放在培养皿的底部。
用吊滴孵化菜三天。要在孵育后收集细胞，请用10毫升PBS轻轻清洗盖子。将包含 EB 的 PBS 转移到 50 毫升塑料管中。
让管子在室温下坐 30 分钟后，小心地取出上经剂。EBs 将留在管的底部。轻轻将 EB 重新暂停至 10 毫升新鲜 EB 分化介质中。
将悬浮液转移到10厘米的细菌培养皿中。三到六天后，使用倒置显微镜检查EB的形成。EB 的大小应该是圆形和均匀的。
将 EB 从两个或三个 10 厘米的盘子中收集到 50 毫升塑料管中。在室温下以 300 倍 g 离心 5 分钟。小心地取出上一杯，并在 10 毫升 PBS 中重新暂停 EBs。
在室温下以300倍g离心，这次为3分钟。取出上一液，并在颗粒中加入两毫升的三辛-EDTA。在37摄氏度下孵育管子15分钟。
在孵育过程中，移液器每三分钟上下一次，以获得单细胞悬浮液。要停止三辛反应，加入八毫升EB分化介质。在新鲜EB介质中重新增殖细胞后，将甲状甲醛加入1%的最终浓度中，在室温下在旋转下孵育细胞10分钟。
通过将甘氨酸加入0.125摩尔的最终浓度来淬火甲醛。完成手稿中描述的固定过程，然后将液氮中的细胞颗粒快速冷冻。轻轻地将细胞颗粒重新插入新鲜准备的冰冷解液缓冲液中，将管子放在冰上。
15分钟后，在摄氏4度下，以1000次g离心，将细胞离心5分钟。丢弃上清液，用500微升冷解液缓冲液清洗颗粒。将颗粒重新填充在 1.5 毫升管中，在 1x 缓冲液 2 中用 50 微升 0.5%SDS，并在 62 摄氏度的加热块中放置管。
10分钟后，从加热块上取出管子，并加入消化缓冲液。通过移液混合，避免过度发泡，并在37摄氏度下孵育管子。为了确保有效的限制酶消化，在这个协议中，我们包括了重复的消化步骤。
这就是为什么在消化缓冲液中重新吸收核也很重要。再添加25微升的消化缓冲液，通过倒置混合，并服用8微升作为未消化的控制。将未消化的控制样品存放在负 20 摄氏度。
接下来，您将添加限制酶 Mbol 的几个等分，在每个等分项后在 37 摄氏度的旋转下孵育。以八微升作为消化的控制样本。为了将两个对照样品脱钩，在10微升蛋白酶K.孵化中加入80微升TE缓冲液，在65摄氏度下孵育一小时。
为了检查消化效率，在0.6%凝胶上运行20微升等分。成功的消化显示片段大多在 3.0 到 5.0 千基对的范围内。准备DNA进行剪切，如手稿中所述。
使用声波器将DNA剪切到150到700个碱基对的大小。将剪切的DNA转移到一个普通的新安全锁管，从同一样品中汇集多个声波。加入温热DNA纯化珠，其量相当于现有体积的1.8倍，然后通过重新增发混合。
孵育五分钟后，用磁架收集珠子。将管子放在磁架中，用一毫升新鲜准备好的80%乙醇清洗珠子两次。在室温下空气干燥珠子两到三分钟后，将珠子重新吸收1倍Tris缓冲液，使DNA脱氧核糖核酸。
利用悬挂-下降法，在ESC分化诱导6天后，获得了EBs的均匀种群。在整个质量控制协议中，对凝胶电泳进行了测量。Mbol 的高效消化可产生小于三个千基对的碎片。
结扎后电泳表明，大多数碎片大于三千基对。声波后，预计碎片大小为 400 到 500 个碱基对。除磷化和单端适配器结扎后，进行了两轮PCR，以放大感兴趣的目标。
每个目标分别放大两个不同的底因对，A 和 B 表示 Pou5f1 位点，C 和 D 表示 T 位点。这导致了大约400个碱基对的DNA涂片。或者，执行多路复用 PCR 以同时放大目标 A 和 C，从而在纯化后产生类似的片段大小。
在这些 4C 配置文件中，浅蓝色框指示在差异化过程中具有动态变化的增强器的位置。在EB分化过程中，染色质区域接触Pou5f1和T基因的启动子。Pou5f1 在 EB 分化期间被向下调节。
相反，在EB分化期间，T被调高。有效的限制酶消化，然后接近结扎的交叉基因组DNA是确保该协议的成功的关键因素。另一件事是底图设计，以询问每个位置的接触图。
此过程非常适合在目标位点询问染色质接触。如果需要全球变化，可以执行全基因组方法，如高 C、启动子捕获高 C 或 HiChIP。
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