Genetics
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Identifikation af forstærker-promotor kontakter i embryolede organer ved kvantitative kromosom kropsbygning Capture (4C)
Chapters
Summary April 29th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi rapporterer om anvendelsen af kvantitativ kromosomkropsformation efterfulgt af sekvensering med høj gennemløb i embryoide kroppe, der stammer fra embryonale stamceller. Denne teknik gør det muligt at identificere og koronere kontakterne mellem formodede smagsforstærkere og promotorregioner for et givet gen under embryonal stamcelledifferentiering.
Transcript
Den præcise spatiotemporale regulering af gener styres af forskellige cis-regulerende elementer, der interagerer mellem dem. Vores protokol gør det muligt kvantitativt at afhøre kromatin kontakter udvalgte loci såsom initiativtagere. Denne teknik giver os mulighed for at identificere og kvantificere interaktionsfrekvenserne mellem forskellige lovgivningsmæssige elementer samtidigt.
At generere embryoid organer, begynde med dyrkning mus embryonale stamceller til 60% sammenløbet. Fjern derefter kulturmediet, og vask to gange med to milliliter steriliseret PBS. Fjern PBS helt, og tilsæt to milliliter celleopdelingsmedium.
Inkuber kulturskålen ved 37 grader Celsius. Efter inkubation i fem minutter tilsættes otte milliliter EB-differentieringsmedium til skålen. At adskille mESC kolonier for at opnå en enkelt-celle suspension, pipette medium op og ned 15 til 20 gange, og overføre suspensionen til en 10-milliliter rør.
Centrifuge cellerne ved 300 gange g ved stuetemperatur i fem minutter. Fjern derefter forsigtigt supernatanten. Efter optælling af cellerne, resuspend cell pellet med EB differentiering medium.
Inverter låget af en 15-centimeter kultur skål. Ved hjælp af en 200-mikroliter multikanal pipette, deponere 20-mikroliter dråber af resuspended celler på låget. Inverter låget forsigtigt, og læg det på den nederste del af dyrn skålen.
Inkuber skålen med hængende dråber i tre dage. Cellerne skal opsames efter inkubation, og låget vaskes forsigtigt med 10 milliliter PBS. Overfør PBS, som skal indeholde eB'erne, til et 50-milliliter plastrør.
Efter at have ladet røret sidde i 30 minutter ved stuetemperaturer, forsigtigt fjerne supernatant. EBs vil blive efterladt i bunden af røret. Forsigtigt resuspenderede EBs i 10 milliliter frisk EB differentiering medium.
Overfør suspensionen til en 10-centimeter bakteriologisk petriskål. Tre til seks dage senere, bruge en omvendt mikroskop for at kontrollere EB dannelse. EB'erne skal være runde og homogene i størrelse.
Saml EBs fra to eller tre 10-centimeter retter i en 50-milliliter plastrør. Centrifuge eBs ved 300 gange g i fem minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt supernatanten, og opsplit eBs i 10 milliliter PBS.
Centrifuge eBs på 300 gange g ved stuetemperatur igen, denne gang i tre minutter. Fjern supernatant, og tilsæt to milliliter trypsin-EDTA til pellet. Inkuber røret ved 37 grader Celsius i 15 minutter.
Under inkubationen, pipette op og ned hvert tredje minut for at opnå en enkelt-celle suspension. For at stoppe trypsin reaktion, tilsæt otte milliliter EB differentiering medium. Efter resuspending cellerne i frisk EB medium, tilsæt paraformaldehyd til en endelig koncentration på 1%Inkuber cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur under rotation.
Slukket formaldehyd ved tilsætning af glycin til en endelig koncentration på 0,125 kindtand. Fuldføre fikseringsprocessen som beskrevet i manuskriptet, og snap-fryse cellen pellets i flydende nitrogen. Forsigtigt resuspend cell pellet i frisklavet iskold lysis buffer, og placere røret på is.
Efter 15 minutter centrifugeres cellerne ved 1.000 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten, og vask pellet med 500 mikroliter af kold lysis buffer. Opslæm pellet i en 1,5-milliliter rør med 50 mikroliter af 0,5% SDS i 1x buffer to, og placere røret i en varmeblok ved 62 grader Celsius.
Efter 10 minutter skal du fjerne røret fra varmeblokken og tilføje fordøjelsesbufferen. Bland godt ved pipettering, undgå overdreven skumdannelse, og inkubere røret ved 37 grader Celsius. For at sikre effektiv begrænsning enzym fordøjelsen, i denne protokol, vi har inkluderet en gentagen trin af fordøjelsen.
Det er derfor, det er også vigtigt at resuspend godt kerner i fordøjelsen buffer. Tilføj yderligere 25 mikroliter af fordøjelsesbuffer, bland ved invertering, og tag otte mikroliter som en ufordøjet kontrol. Opbevar den ufordøjede kontrolprøve ved negative 20 grader Celsius.
Dernæst vil du tilføje flere aliquots af begrænsningen enzym Mbol, inkubering ved 37 grader Celsius under rotation efter hver aliquot. Tag otte mikroliter som en fordøjet kontrolprøve. For at afkole begge kontrolprøver, tilsættes 80 mikroliter TE-buffer i 10 mikroliter proteinase K.Incubate ved 65 grader Celsius i en time.
For at kontrollere fordøjelsen effektivitet, køre 20-microliter aliquots på en 0,6% gel. Vellykkede fordøjelser viser fragmenter for det meste i intervallet 3,0 til 5,0 kilobase par. Forbered DNA til klipning som beskrevet i manuskriptet.
Brug en soniker til at forskyde DNA'et til en størrelse på 150 til 700 base par. Overfør det forskåret DNA til et normalt nyt safe-lock rør, der samler flere sonikeringer fra den samme prøve. Tilføj opvarmede DNA rensning perler i en mængde svarende til 1,8 gange den eksisterende volumen, og bland ved resuspending.
Efter fem minutters inkubation, indsamle perlerne med en magnetisk rack. Hold rørene i den magnetiske rack, vask perlerne to gange med en milliliter frisklavet 80% ethanol. Efter lufttørring af perlerne ved stuetemperatur i to til tre minutter, eluter DNA ved at resuspending perlerne i 1x Tris buffer.
Ved hjælp af hængende faldmetode blev der opnået en homogen population af EBs seks dage efter induktionen af ESC-differentiering. Gel elektroforese blev udført i hele protokollen for kvalitetskontrol. Effektiv fordøjelse af Mbol resulterer i fragmenter af mindre end tre kilobase par.
Elektroforese efter ligation viste, at de fleste fragmenter var større end tre kilobase par. Fragmenteringsstørrelser på 400 til 500 basispar forventes efter sonikering. Efter afphosphorylation og single-end adapter ligation, to runder af PCR blev udført for at forstærke målene for interesse.
Hvert mål blev forstærket separat med to forskellige primer par, A og B for Pou5f1 locus og C og D for T locus. Dette resulterede i en DNA smøre omkring 400 base par. Alternativt, multiplex PCR blev udført for at forstærke mål A og C samtidigt, hvilket resulterer i en lignende fragment størrelse efter rensning.
I disse 4C-profiler angiver de lyseblå bokse placeringen af smagsforstærkere med dynamiske ændringer under differentiering. Chromatin regioner kontakt initiativtagere til Pou5f1 og T gener under EB differentiering. Pou5f1 blev nedreguleret under EB-differentiering.
Omvendt blev T upregulated under EB-differentiering. Effektiv begrænsning enzym fordøjelse og derefter nærhed ligation af passage genomiske DNA er nøglefaktorer for at sikre succes for denne protokol. En anden ting er primer design til at afhøre kontakt kort af hver locus.
Denne procedure er ideel til at afhøre kromatin kontakt på målrettet loci. Hvis der er behov for globale ændringer, kan der udføres tilgang til hele verden af genomer såsom Hi-C, promotorfanger hi-c eller HiChIP.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
