Neuroscience
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Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas
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Summary June 14th, 2020
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O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.
Transcript
O dobro na eletroporação utero é um método poderoso para estudar os aspectos importantes da corticogênese dos mamíferos, como a interação entre células neurônios, gerada em diferentes locais e idades de desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de examinar interações não perturbadas entre essas diferentes populações celulares de forma rápida, detalhada e barata. Uma implicação impressionante do nosso método é que ele facilita uma melhor compreensão de quão semelhante nossa fiação é alterada em distúrbios neuronais como autismo e esquizofrenia.
Este estudo não se restringe ao neocórtex, mas também pode ser empregado para analisar interações celular a célula, em áreas exocorticais como o sepalium ou cerebelo. Um dos passos mais desafiadores é a injeção de DNA nos ventrículos laterais dos embriões primitivos. O uso de uma fonte de luz brilhante é essencial para injeções bem sucedidas.
Para cada cirurgia, primeiro prepare uma solução de 10 microliter contendo um microliter de corante verde rápido, um micrograma por microliter plasmid DNA solução de interesse para cada plasmídeo, e o volume apropriado no tampão de TE livre de endotoxina. E pré-carregar uma pipeta microcapilar de vidro com a solução de DNA preparada apropriada. Para a primeira cirurgia de eletroporação do útero, aplique pomada nos olhos de um rato grávida anestesiado adequadamente cronometrado, e use uma navalha para raspar o abdômen.
Desinfete a pele exposta duas vezes com sequenciais 70% de etanol e lenços umedecidos de iodo antes de prosseguir com a incisão no lado direito do abdômen. Uma vez que o útero esteja acessível use fórceps de anel para extrair cuidadosamente o órgão. Usando um tubo aspirador controlado pela boca, injete aproximadamente 0,5 microliters de solução no ventrículo lateral do hemisfério esquerdo de embriões E11.5 para a estratégia A.Ou no ventrículo lateral do hemisfério direito de embriões E13.5 para a estratégia B, até que o corante verde rápido seja visível dentro do ventrículo.
Quando toda a solução tiver sido injetada, coloque eletrodos de platina tipo fórceps lateralmente ao redor da cabeça dos embriões injetados, com o polo positivo orientado para a parede medial para atingir a bainha cortical para a estratégia A, ou orientado para o córtex lateral para a estratégia B, tendo o cuidado de evitar o coração e a placenta. Use um eletroporater de ondas quadradas para aplicar a sequência apropriada de pulsos elétricos para cada idade embrionária, conforme indicado na tabela. Quando todos os embriões tiverem sido injetados e eletroporados, use fórceps para retornar cuidadosamente o útero à cavidade abdominal, e encher o abdômen com soro fisiológico quente.
Usando uma sutura de agulha 6-0, feche a parede abdominal e feche cuidadosamente a incisão da pele. Em seguida, devolva o animal para sua gaiola de origem com monitoramento até a recuperação completa. Dois dias após a cirurgia inicial, confirme que o rato está apresentando comportamento normal, e não apresenta sinais de dor ou angústia.
Antes de preparar o animal para o segundo na eletroporação utetre como apenas demonstrado. Injete 0,5 microlitres da solução de DNA desejada no ventrículo cerebral lateral esquerdo de embriões E13,5 para a estratégia A, e no ventrículo cerebral lateral esquerdo de E15,5 embriões para a estratégia B.Após cada injeção, coloque os eletrodos com o polo positivo orientado para o córtex lateral do hemisfério injetado para estratégia A e estratégia B.E embriões eletroporatos como indicado na tabela. Quando a eletroporação estiver terminada, devolva o útero à cavidade abdominal e complete a cirurgia e os cuidados pós-cirúrgicos, conforme demonstrado.
Ao implementar a estratégia A, quatro dias após a segunda eletroporação, colhimento do útero do embrionário dia 17,5 camundongo fêmea grávida em uma placa de petri de PBS no gelo. E use pinças para transferir os embriões para um novo prato de PBS sob um microscópio dissecando. Usando fórceps, segure cuidadosamente a cabeça de cada embrião para facilitar a remoção da pele sobre a cabeça e o crânio.
Use fórceps ou espátula para levantar os cérebros expostos. Em seguida, use a colher para transferir cada cérebro para poços individuais de uma placa de 48 poços contendo cerca de 600 microliters de solução fixa por poço. Quando todos os cérebros tiverem sido coletados, conserte os cérebros a quatro graus Celsius durante a noite em um agitador orbital, seguido por três lavagem de dez minutos na PBS.
Após a última lavagem, incorpore os cérebros em um ponto de fusão 4% baixo surgiu na PBS por cerca de dez minutos. Depois que a agarose se solidificar, use cola cianoacrilato para fixar cada cérebro a um suporte de tecido vibratome olfativo lado para cima. Coloque o suporte dentro do recipiente de vibratome e encha o recipiente com PBS.
Em seguida, use o vibratome e um pincel para obter seções de série coronal de 100 micrômetros de espessura. Transferindo até sete seções por poço e seis poços por embrião, em uma nova placa de 48 poços contendo 600 microliters por poço de PBS fresco, complementados com conservantes antifúngicos à medida que são coletados. Quando todas as seções tiverem sido adquiridas, use um pincel fino para montar cada seção em um slide de microscópio de vidro, e cubra-as com uma mancha de vidro para avaliação da eficácia da eletroporação em um microscópio de epifluorescência vertical.
Ao implementar a estratégia B, no dia 15 pós-natal, após confirmar a falta de resposta ao topinch, fixar o rato na posição supina e usar uma tesoura para fazer uma incisão de pele média para expor a caixa torácica e o diafragma, e cortar o diafragma para ter acesso ao coração. Usando uma tesoura fina, faça uma incisão no átrio direito e use uma agulha de 25 gage conectada a um tubo flexível a uma bomba de perfusão peristáltica para penetrar no ventrículo esquerdo. Quando a agulha estiver no lugar, entregue pelo menos 25 mililitros de 4% de paraformaldeído por perfusão transcárdia, a um fluxo constante a 5,5 mililitros por minuto.
Após aproximadamente cinco minutos, pare a perfusão e use uma tesoura para remover a pele sobre a cabeça. Remova o crânio e use uma espátula para remover o tecido cerebral. Coloque o cérebro em um poço de uma placa de 24 poços contendo 1,5 mililitros de paraformaldeído fresco de 4%, para uma incubação durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital.
Em seguida, adquira 40 seções de micrômetros do cérebro pós-natal como apenas demonstrado. Para imagens de fatias cerebrais embrionárias e pós-natais, coloque os slides contendo as seções cerebrais montadas de interesse em um suporte de slides de microscópio. Introduza o suporte do controle deslizante no microscópio confocal e selecione o canal apropriado para os fluorofores usados no experimento.
Realize a varredura de amostras para obter imagens de mapa de cada seção cerebral em dois comprimentos de onda diferentes para uma visão geral da saída de eletroporação dupla. Uma vez concluída, selecione a lente 10x, no modo de observação de lapso de tempo de pilha Z de várias áreas. Em cada uma das regiões XY selecionadas, defina os perímetros de imagem apropriados, bem como a profundidade da varredura ao longo do eixo Z de acordo com os planos da amostra, em que a fluorescência é visível.
Obtenha imagens de baixa ampliação de todas as regiões escolhidas e exporte as imagens do formato OIF para TIFF no software de visualizador de microscópio. Em seguida, selecione a lente 60x e capture imagens de alta ampliação como apenas demonstrado, para observar as interações célula-célula em um nível mais detalhado. A diferença temporal entre o duplo em cirurgias de eletroporação uteral permite que as células toresias cag direcionadas no dia embrionário 11.5 em um de seus locais de origem cheguem à zona marginal do neocórtex lateral, incluindo a área somatosensorial, a tempo de estabelecer contatos com neurônios de projeção cortical, rotulados no dia embrionário 13.5.
Os principais processos de neurônios de projeção expressando aumento do GFP na zona marginal do córtex, e misturam-se com os processos de M-cherry expressando células cataretziais. No útero eletroporação no dia embrionário 13.5, o uso de um plasmídeo expresso bfp facilita a rotulagem de neurônios de projeção em diferentes camadas corticais. Uma segunda eletroporação no lado contralateral do dia embrionário 15.5 tem como alvo a subpopulação dos neurônios de projeção calosal da camada superior, mas não os neurônios de projeção de camada inferior que se desenvolvem em estágios anteriores.
Os neurônios alvos da camada superior estendem seus axônios ao hemisfério contralateral, com o padrão de arborização característico. A alta ampliação permite uma visualização mais detalhada da invação do eixo calisal dos neurônios de projeção direcionados dentro do hemisfério contralateral. Ao tentar este protocolo, é importante planejar o tempo de eletroporação, o hemisfério para injetar, e a posição dos eletrodos de acordo com as populações celulares a serem alvo.
Após este procedimento todos os métodos, como a eletroporação, são os interessantes. Para ambos os tipos de células pode ser realizada para estudar possíveis alterações de circuito in vivo. Utilizando essa técnica, é possível estudar interações finas entre duas células-alvo diferentes.
Incluindo novas informações científicas in vivo, pela eletroporação de proteínas sinápticas fluorescentes.
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