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रूपात्मक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए भ्रूण सुपीरियर सर्वाइकल गंगलिया से चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स culturing
Chapters
Summary September 27th, 2020
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यह पत्र बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया से भ्रूण चूहे सहानुभूति न्यूरॉन्स के अलगाव और खेती का वर्णन करता है। यह इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए न्यूरोनल अर्क तैयार करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान करता है।
Transcript
इस वीडियो में, हम रूपात्मक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए भ्रूण चूहों के बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया की खेती का प्रदर्शन करेंगे। विच्छेदन शुरू करने से पहले, नियंत्रण और विच्छेदन मीडिया तैयार करें। नियंत्रण माध्यम में एफ-12 और कम ग्लूकोज डीएमईएम होता है जो इंसुलिन-सेलेनियम-ट्रांसफरिन मिश्रण, ग्लूटामाइन, तंत्रिका विकास कारक और बीएसए के साथ पूरक होता है।
विच्छेदन माध्यम में एल-15 पेन-स्ट्रेप और बीएसए के साथ पूरक होता है। मीडिया की तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए पांडुलिपि को देखें। न्यूरॉन्स की खेती के लिए प्लेटों की तैयारी।
पॉली-डी-लिसाइन के एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्टॉक को बाँझ आसुत पानी के साथ 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर तक पतला करें। प्रोटेओमिक या जीनोमिक विश्लेषण के लिए, विच्छेदन से एक से दो दिन पहले, पॉली-डी-लिसाइन के लगभग दो मिलीलीटर बाँझ 100 ग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ छह-अच्छी प्लेटों को कोट करें। यह अच्छी तरह से सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेटों को लपेटें और प्लेटों को चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्टोर करें। विच्छेदन के दिन, विच्छेदन शुरू होने से पहले, कुओं से पॉली-डी-lysine समाधान को हटा दें और बाँझ आसुत पानी के साथ पांच बार कुओं को कुल्ला करें, इसके बाद एक बार कम ग्लूकोज वाले डीएमईएम के साथ। गैंगलिया के एंजाइमैटिक पाचन के दौरान, कोशिकाओं को चढ़ाना से लगभग एक घंटे पहले, प्लेटों से डीएमईएम को हटा दें और इसे 0.3 मिलीलीटर नियंत्रण माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
एक आर्द्र कक्ष में 5% CO2 के तहत ३५ डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को स्टोर करें । हुड में, विच्छेदन के लिए निम्नलिखित वस्तुओं की स्थापना करें। प्रत्येक ट्यूब में विच्छेदन मीडिया के बारे में 20 मिलीलीटर के साथ चार 50 मिलीलीटर बाँझ शंकु ट्यूब।
विच्छेदन मीडिया के १.५ मिलीलीटर के साथ चार बाँझ ३५ मिलीमीटर व्यंजन । अपकेंद्री के लिए विच्छेदन मीडिया के 20 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ ५० मिलीलीटर शंकु नली । गैंगलिया को अपकेंद्री करने के लिए १ १५ मिलीलीटर बाँझ शंकु नली, एक बाँझ 10 मिलीलीटर ट्यूब अलग कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
कम से कम एक मिनट के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी को स्टरलाइज करने के लिए एक सूखे मोतियों की स्टरलाइजर का उपयोग करें। जानवरों से जुड़े अध्ययनों में की गई सभी प्रक्रियाओं को कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था । कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में पशु देखभाल और उपयोग के दिशा निर्देशों को स्वास्थ्य के लिए राष्ट्रीय संस्थानों में प्रयोगशाला पशु कल्याण के कार्यालय द्वारा प्रदान किए गए दिशा निर्देशों के आधार पर विकसित किया गया ।
गर्भवती चूहे से E21 भ्रूण को हटाना। ध्यान दें कि गर्भाशय सींग को हटाने के हुड के बाहर किया जा सकता है अगर आसपास के क्षेत्र को अच्छी तरह से निष्फल किया जाता है। सीओ 2 साँस लेना के साथ एक गर्भवती चूहे को इच्छामृत्यु।
पेट क्षेत्र से फर कतरनी और 70% शराब के साथ क्षेत्र में त्वचा पोंछ इसे बंध्याकरण करने के लिए। बाँझ कैंची और संदंश के एक ताजा सेट का उपयोग करना, त्वचा के माध्यम से कटौती और फिर मांसपेशियों भ्रूण युक्त गर्भाशय सींग का पर्दाफाश करने के लिए । भ्रूण के साथ गर्भाशय सींग निकालें, कैंची और संदंश का एक नया सेट का उपयोग कर, इस प्रक्रिया में आंतों को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना।
भ्रूण के साथ गर्भाशय सींग को 150 मिलीमीटर बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और उन्हें हुड में स्थानांतरित करें। संदंश और कैंची के एक नए सेट का उपयोग करना, गर्भाशय सींग से भ्रूण को हटा दें और भ्रूण को एमनियोटिक झिल्ली और प्लेसेंटा से अलग करें। भ्रूण को इच्छामृत्यु के लिए, दाहिने हाथ के नीचे मिडलाइन के साथ भ्रूण की रीढ़ की हड्डी काटें।
इससे एससीजी को हटाने के दौरान कैरोटिड धमनी से रक्तस्राव कम होगा। इन भ्रूणों को विच्छेदन मीडिया युक्त तैयार 50 मिलीलीटर शंकु नलियों में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि भ्रूण मीडिया में डूबे हुए हैं।
प्रत्येक ट्यूब तीन भ्रूण तक पकड़ कर सकते हैं । भ्रूण से बेहतर सर्वाइकल गैंगलियन का अलगाव। विच्छेदन मीडिया से एक पिल्ला को बाँझ 150 मिलीमीटर पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें जो सब्सट्रेट पर अपनी पृष्ठीय सतह के साथ ठोस सब्सट्रेट से भरा हुआ है।
तीन बाँझ 23 गेज सुई का उपयोग करना, प्रत्येक हाथ के नीचे एक सुई और मुंह के माध्यम से एक तिहाई सुई के साथ पकवान के लिए पब पिन ध्यान से गर्दन हाइपरएक्सटेंड । गर्दन क्षेत्र में त्वचा के माध्यम से काट बाँझ ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए नीचे लार ग्रंथियों का पर्दाफाश । इन ग्रंथियों को ठीक संदंश का उपयोग करके हटा दें।
क्रमशः क्लैविकल और ट्रेकिया के पास स्टर्नोकलीडोमास्टोइड और ओमोहॉयइड मांसपेशियों का पता लगाएं। सबसे पहले, ट्रांसवर्स स्टर्नोकलिडोमेस्टोमोटोटोइड मांसपेशियों को काटें। और फिर ठीक संदंश का उपयोग करके पतली ओमोहॉयड मांसपेशी को ध्यान से काट लें।
एक बार इन मांसपेशियों को हटा दिया जाता है, पूर्वकाल अंत पर कैरोटिड धमनी में विभाजन, कैरोटिड धमनी में इस कांटा के तहत स्थित एससीजी के साथ श्वासनली के दोनों ओर दिखाई देगा। बंद संदंश का उपयोग करना, एससीजी की कल्पना करने के लिए कैरोटिड धमनी को धीरे से उठाएं। एससीजी के दोनों ओर एक संदंश का उपयोग करके, कैरोटिड को बाहर निकालें और इसे तैयार बाँझ 35 मिलीमीटर व्यंजनों में स्थानांतरित करें।
इस ऊतक में सबसे अधिक संभावना कैरोटिड धमनी के साथ एससीजी, नोडोज गैंगलिया के साथ वेगस तंत्रिका, साथ ही क्षेत्र में मांसपेशियों या वसा के अन्य खंडों में शामिल होंगे। विच्छेदन प्रक्रिया को दूसरी तरफ दोहराएं। शेष विच्छेदन उल्लिखित कदम के साथ जारी रखने से पहले सभी भ्रूण से एससीजी निकालें ।
ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण की सुविधा के लिए 35 मिलीमीटर व्यंजनों में से दो के बीच अलग ऊतकों को वितरित करें। एससीजी के बाद प्रसंस्करण। एससीजी को विच्छेदित ऊतकों से अलग करने के लिए, पहले कैरोटिड विभाजन के पास के क्षेत्र से बचने के लिए देखभाल करने के लिए मांसपेशियों या वसा जैसे किसी भी बाहरी ऊतक को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें।
एक बार इन ऊतकों को हटा दिया गया है, दो गैंगलिया दिखाई दे रहे हैं। नोडोज गैंगलियन छोटा और गोलाकार होता है जबकि एससीजी बादाम के आकार का होता है। धीरे-धीरे वेगस तंत्रिका और नोडोज़ गैंगलिया को कैरोटिड से अलग करने के लिए वेगस तंत्रिका पर खींचें और फिर एससीजी को कैरोटिड धमनी से अलग करें।
एससीजी को घेरने वाले कैप्सूल को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। एससीजी को एक नए 35 मिलीमीटर कल्चर डिश में ट्रांसफर करें। इस प्रक्रिया को सभी विच्छेदित ऊतक नमूनों के साथ दोहराएं।
कोट एक निष्फल, कपास-विच्छेदन मीडिया के साथ कांच पिपेट प्लग करने के लिए पिपेट दीवारों का पालन करने से ऊतक को रोकने के लिए । विच्छेदन मीडिया को कोलेजनेस प्रकार II के बाँझ दो मिलीलीटर के साथ बदलने के लिए पिपेट का उपयोग करें, कैल्शियम और मैग्नीशियम मुक्त एचबीएसएस में टाइप II को अस्वीकार करें और ऊतकों को तोड़ने में मदद करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ध्यान दें कि इनक्यूबेशन बार कोलेजनेस/डिस्पास के विभिन्न बैचों के साथ अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है और आमतौर पर 40 मिनट से एक घंटे तक होती है।
इनक्यूबेशन के बाद, एससीजी और कोलेजना/डिस्पास को बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। प्लेटों को कुल्ला करने और ट्यूब के समाधान को स्थानांतरित करने के लिए विच्छेदन मीडिया का उपयोग करें। मात्रा को लगभग 10 मिलीलीटर तक लाने के लिए पर्याप्त विच्छेदन मीडिया जोड़ें।
200 x g पर सेंट्रलाइज, 1, 000 से 1, 200 आरपीएम पर पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना गोली। गोली को उखाड़ न फेंकने का ख्याल रखते हुए, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। विच्छेदन मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से खर्च करें, अपकेंद्री दोहराएं और सुपरनेट को त्यागें।
संस्कृति माध्यम के एक से दो मिलीलीटर के साथ बदलें। एक संकीर्ण बोर, तुला टिप बाँझ पाश्चर पिपेट का उपयोग करना, संस्कृति माध्यम के साथ इसे पूर्व कोट करना, यांत्रिक रूप से पांच से छह बार धीरे-धीरे ट्रिट करके झुरमुटों को अलग करें। बड़े झुरमुटों को लगभग एक मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें और सुपरनैट सेल निलंबन को एक नए 10 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
एससीजी के लगभग पूर्ण वियोजन सुनिश्चित करने के लिए हर बार ट्रिट्यूशन के बढ़ते बल के साथ इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। 10 मिलीलीटर ट्यूब को पहले ट्रिट्यूशन से सुपरनेटेंट के साथ प्रत्येक दौर की ट्रिटुरेशन के बाद सुपरनैटोर्ट स्थानांतरित करें। मात्रा को आठ से 10 मिलीलीटर तक लाने के लिए पर्याप्त संस्कृति मीडिया जोड़ें।
धीरे-धीरे एक सेल सस्पेंशन मिलाएं और हीमोसाइटोमीटर के साथ सेल घनत्व की मात्रा निर्धारित करें। प्रयोगों के लिए उपयुक्त सेल घनत्व पर कुओं में सेल निलंबन वितरित करें। कुओं में कोशिकाओं का वितरण सुनिश्चित करने के लिए चढ़ाना प्रक्रिया के दौरान लगातार सेल निलंबन मिलाएं।
रूपात्मक विश्लेषण के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 8, 000 कोशिकाओं के आसपास कोशिकाओं प्लेट । और जीनोमिक और प्रोटेओमिक प्रोटोकॉल के लिए, कोशिकाओं को 30, 000 कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से उच्च प्लेट करें। प्लेटों को एक आर्द्रीकृत कक्ष बनाने के लिए नीचे बाँझ पानी के साथ एक ग्लास डेसीकेटर में स्थानांतरित करें।
सीलिंग से पहले, डिसिकेटर में 5% CO2 वातावरण प्राप्त करने के लिए पर्याप्त CO2, लगभग 120 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। प्लेटों को 35.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। इसे प्रोटोकॉल में डे जीरो के रूप में जाना जाता है।
इन प्लेटों को नियमित 5% CO2 इनक्यूबेटर में भी बनाए रखा जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि तापमान और पीएच परिवर्तन को कम करती है और क्रॉस-संदूषण को रोकने में भी मदद करती है। सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स और उपचार का रखरखाव।
इन चित्रों को शून्य, एक दिन, और पांच दिन पर अलग बेहतर ग्रीवा गैंगलिया कोशिकाओं को दिखाते हैं । दिन शून्य छवि चढ़ाना पर कोशिकाओं को दिखाता है। डे जीरो पर चढ़ाई गई कोशिकाओं में न्यूरोनल और नॉन-न्यूरोनल दोनों कोशिकाओं का मिश्रण होता है।
एक दिन, चढ़ाना के बाद 24 घंटे, ध्यान से संस्कृति मीडिया के आधे को हटाने और दो माइक्रोमोलर आरा-सी, साइटोसाइन डी-arabinofuranoside, एक विरोधी mitotic एजेंट के साथ बदलें । 48 घंटे के लिए कोशिकाओं पर उपचार छोड़ दें। आमतौर पर उपचार की यह लंबाई संस्कृति में गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं को खत्म करने के लिए पर्याप्त है।
तीन दिन, धीरे से आधे माध्यम आकांक्षी और नियंत्रण माध्यम के साथ बदलें । चार दिन, कोशिकाओं को प्रयोगात्मक उपचार के लिए तैयार हैं । उचित माध्यम के साथ हर दूसरे दिन संस्कृतियों फ़ीड।
धीरे से ताजा माध्यम के साथ अच्छी तरह से माध्यम के आधे की जगह । पांच दिन की तस्वीर कोई dendritic विकास के साथ व्यापक अक्षीय विकास से पता चलता है मनाया । डेंड्रिटिक विकास को प्रेरित करने के लिए, न्यूरॉन्स को मैट्रिगेल पर उगाया जा सकता है या हड्डी मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन-7 के मिलीलीटर प्रति 10% सीरम या 50 नैनोग्राम के साथ इलाज किया जा सकता है।
चित्रा दो बीएमपी-7 के साथ उपचार के बाद E21 चूहा एससीजी न्यूरॉन्स के न्यूरोनल आकृति विज्ञान में परिवर्तन से पता चलता है । 10 एक्स आवर्धन में प्रतिनिधि चरण विपरीत माइक्रोग्राफ पैनल ए में नियंत्रण न्यूरॉन्स में एक्सॉन के साथ परिपत्र न्यूरोनल सेल बॉडी को दिखाते हैं, और कई छोटे डेंड्राइट जैसी प्रक्रियाओं के साथ न्यूरॉन्स जब पैनल बी-7 में तीर द्वारा दिखाए गए बीएमपी-7 के साथ उचित उपचार के बाद उचित उपचार के बाद उपयुक्त उपचार के बाद इम्यूनोसाइटिक विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है जीनोमिक विश्लेषण के लिए और बायोकेमिकल अध्ययन के लिए बायोकेम्पिकल अध्ययन के लिए , जैसे प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए। प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए इम्यूनोस्टेपिंग और नमूना तैयारी के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए पांडुलिपि को देखें।
चित्रा तीन सुसंस्कृत भ्रूण चूहों सहानुभूति न्यूरॉन्स में मानचित्र-2 प्रोटीन से इम्यूनोदाता से पता चलता है । पैनल एक डी शो के माध्यम से सुसंस्कृत एससीजी न्यूरॉन्स नियंत्रण मीडिया और पैनलों ई के साथ इलाज एच शो न्यूरॉन्स के माध्यम से बीएमपी-7 के साथ इलाज ५० नैनोग्राम प्रति मिलीलीटर पर पांच दिनों के लिए । सी और जी में माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 के साथ न्यूरॉन्स के इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला दिखाने वाले प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ, बी और एफ में चरण विपरीत माइक्रोग्राफ के साथ डी और एच में एक परमाणु दाग, और माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 से एक और डी इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला में तीन चैनलों के उभरने सेल शरीर और पैनल सी में नियंत्रण न्यूरॉन्स के समीपस्थ अक्षों में मौजूद है और सेल शरीर में मानचित्र-2 प्रोटीन से दाग , और बीएमपी-7 उपचारित न्यूरॉन्स में dendrites पैनल जी में है यहां बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया नियंत्रण मीडिया, जो 1, १०० प्रोटीन का पता चला के साथ इलाज का एक नमूना रन है ।
पैंथर डाटाबेस का उपयोग कर जीन ऑन्टोलॉजी में पाया गया कि अधिकांश प्रोटीन साइटोप्लाज्मिक थे । हालांकि, नमूने में सेलुलर जंक्शनों पर झिल्ली से बंधे प्रोटीन और प्रोटीन थे । इस विश्लेषण से यह भी पता चला है कि प्रोटीन जो न्यूरोनल सिग्नलिंग रास्तों की एक विस्तृत सरणी में शामिल हैं, नमूने में पाए गए थे ।
अंत में, इस वीडियो को देखने के बाद, आपको रूपात्मक और प्रोटेरोमिक विश्लेषण के लिए चूहे भ्रूण बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलियन न्यूरॉन्स को अलग और संस्कृति में सक्षम होना चाहिए। यह काम कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में संकाय विकास कोष और ग्रीष्मकालीन अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।
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