Neuroscience
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成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化
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Summary July 2nd, 2020
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これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。
Transcript
ここで提示されるプロトコルは、成人および老化したマウス海馬スライスの調製中に過度の低酸素損傷を減少させ、成熟したおよび老化した神経回路の機能を研究するための主要な障害を取り除く。ナトリウムフリー溶液中の低体温の導入は、切断後最大10時間健康で、長期的なフィールド録音とパッチクランプ研究の両方に適した海馬スライスをもたらす。海馬スライスを調製するこの方法は、定義上老化脳製剤を必要とする神経変性疾患の動物モデルに特に関連する可能性がある。
このプロトコルの最も重要なステップは、氷冷溶液を用いた経心拡散を介した低体温症の導入である。いくつかの練習で、研究者はこのステップを確実に実行することができます。回復チャンバーとその後の記録のためのaCSF溶液の1リットルを準備することで始めます。
次に、経心拡散および切断工程用に300ミリリットルのNMDG-aCSFを調製します。振動するミクロトーム切断トレイと取り付けディスクをマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。回収チャンバーを準備するには、メッシュを保持するスライスのすぐ上にそれを充填し、室温でベンチにチャンバーを維持バブラーを開始します。
氷の結晶が表面とボトルの壁に形成され始めるまで、冷凍庫でNMDG-aCSFの全体の300ミリリットルを冷やします。冷やしたNMDG-aCSFを入れたボトルを氷の上に置き、溶液を0°Cと2°Cの間に保ちます。ティッシュ取り付けディスクを冷凍庫から取り出し、必要に応じて乾かします。
マウスの脳の大きさについて5%寒天のブロックを切り取り、シアノアクリル接着剤の薄い層を使用してディスクの中央に接着します。氷の上に接着した寒天でディスクを置き、使用する準備ができるまでペーパータオルで覆います。カッティングトレイを冷凍庫から取り出し、ミクロトームに入れ、氷で囲んでブレードを積みます。
脳解剖のために事前にすべてのツールを準備します。心筋灌流用の蠕動ポンプを設置します。ポンプチューブの片側をアイスNMDG-aCSFでボトルに挿入し、もう一方の側に27ゲージの針を装着します。
ポンプ速度を毎分約3.5ミリリットルに設定します。この速度では、NMDG-aCSFの流出は高速なトリップであり、連続的なフローではありません。おむつの上にマウスを背の上に置きます。
続行する前に、つま先ピンチを行うことにより、マウスが麻酔の外科面にあることを確認した。マウスは反応せず、胸と腹部が露出するように前脚と後ろ足をテーピングする必要があります。胸骨の下から喉に行く、胸の皮膚の大きなパッチを切り取ります。
胸骨を鉗子でつかみ、そっと持ち上げ、胸腔が露出するまで両側のリブケージを切り抜け始めます。横隔膜を切り抜き、肋骨ケージのフラップを細い筋肉を介して取り付けたままにします。露出した胸腔にフォールバックすることなく、それを脇に置くことも可能であるはずです。
心臓がまだ鼓動していることを確認し、肝臓のほとんどが見えるようにしてください。左心室に針を挿入し、右よりも明るく見えます。針を安定させるために、体の左側の残りの肋骨を通してそれを駆動します。
暗い赤い色の右心房を見つけ、小さいはさみでそれを切り取ります。血液が流れ出し始めるはずです。ポンプを起動し、赤から茶色に色を変更する肝臓を観察します。
肝臓の色を監視し、肝臓が淡い茶色になるまで灌流を続けます。ポンプを数分間実行します。動物の体温は摂氏28〜29度に下がる必要があり、その鼻は触れるに冷たいはずです。
大きな切断ハサミでマウスの首を切り落とし、10番の刃を持つメスを使って頭蓋骨の上の皮膚を切り開きます。小さな斜められたはさみで、真中線で頭蓋骨を切ります。次に、ナンバー3の鉗子を使用して頭蓋骨の右半分と左半分を詮索し、硬膜を取り除くように注意してください。
ヘラでそれをすくい取ることによってオフホワイト色であるべき脳を取り除き、氷の上のNMDG-aCSF溶液に落とします。そこには1分間放置してください。NMDG-aCSFから脳を取り出し、フィルターペーパーの上に置きます。
前脳の鼻の端から正中線を中心とした60度のツールで、組織の60度のくさびを切って取り除きます。海馬スライスに適切な角度を与えるように、取り付け面のカット側を使用してください。メスで中半球を中間線に分け、取り付けディスクに接着します。
取り付けディスクを氷から取り出し、必要に応じて乾かします。その後、寒天ブロックの前に各半球を接着し、側面を切り取ります。両半球の腹側が寒天ブロックに触れ、両半球の裏側がブレードに面していることを確認します。
カット側に接着する場合、各半球は、その場での裏海馬の横切りスライスを保証する方法でブレードに対して相対的に向き合う必要があります。円盤を半球に沈め、氷冷カルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む切断室に浸します。400マイクロメートルのセクションを切断し、カットオフチップ付きの使い捨て可能なトランスファーピペットを使用して、室温でカルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む回収室にスライスを移します。
残りの切片を切断し、10分以上かけて回復室に移し、歩行海馬領域から合計8〜10スライスを切断します。記録する前に約2時間室温でスライスをインキュベートします。このプロトコルは、成体マウスから海馬スライスを生成するために使用されました。
CA1分野およびsubiculumの多数の錐体細胞は、赤外差動対比顕微鏡下で観察された場合、健康な細胞の特徴である低コントラストで現れる。パッチクランプの記録は、生後6ヶ月以上のマウスのCA1ニューロンから得ることができます。ここでの実験例では、制御条件に対してNMDA-LTDが誘導された後に、ミニチュア興奮性ポストシナプス電流の頻度を測定した。
NMDA-LTD誘導後のニューロンでは、縮小励起後の過動電流の頻度が低く、CA1におけるあらすじの活性依存剪定を示す。振幅の変化は検出されませんでした。mEPSCの記録の間に、CA1細胞もまた、生物細胞を満たし、無傷の樹状の樹状樹状および錐体ニューロンの健康な細胞習慣がここで見ることができる。
細胞全体の蛍光色素の強い分布は異なった条件の樹状突起および樹状棘の分析を可能にする。約170%のCA3-CA1シナプスの長期増強(LTP)が観察され、LTPに必要なシグナル伝達カスケードの維持が成体マウスから調製されたスライスに存在することを示唆した。堅牢なフィールド興奮性ポストシナプス電位信号は、ネットワーク接続も維持されたことを示唆しています。
プロトコルの2つの重要な側面は、低体温を誘導する氷冷溶液を用いた心筋拡散と、細胞毒性浮腫を防ぐための溶液中のナトリウムイオン代替品としてのNMDGの導入である。これらの予防措置を使用して、急性のスライスは、任意の脳領域から調製することができる。また、この方法で作製したスライスは、2光子または広視野顕微鏡を用いたカルシウムおよび電圧イメージングに使用することができる。
このプロトコルは、老化した動物からの急性海馬スライスの標準化された準備の基礎となり、神経変性疾患メカニズムの文脈における研究間の比較を容易にする可能性がある。
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