Neuroscience
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न्यूरॉनल विकास के दौरान रोस लाइव सेल इमेजिंग
Chapters
Summary February 9th, 2021
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यह प्रोटोकॉल तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान एच2ओ2की शारीरिक सिग्नलिंग भूमिकाओं का आकलन करने के लिए सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और लार्वा में आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के उपयोग का वर्णन करता है। इसे विभिन्न सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है और सामान्य विकास में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक उपचारों के साथ संशोधित किया जा सकता है।
Transcript
हमारा प्रोटोकॉल सुसंस्कृत जेब्राफिश न्यूरॉन्स और लार्वा में हाइड्रोजन पेरोक्साइड बायोसेंसर के उपयोग का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को सामान्य शरीर विज्ञान और रोगविज्ञान में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की भूमिका को विच्छेदन करने में मदद करेगा। इस तकनीक का मुख्य लाभ जीवित जानवरों और सुसंस्कृत कोशिकाओं में हाइड्रोजन पेरोक्साइड का वास्तविक समय पता लगाना है।
इस विधि को कृंतक मॉडल प्रणाली जैसे अन्य जानवरों पर लागू किया जा सकता है। कवरस्लिप तैयार करने के लिए, 100% इथेनॉल में संग्रहीत एसिड-साफ कवर्लिप्स का उपयोग करें। भंडारण कंटेनर से एक कवरस्लिप को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें, और अवशिष्ट इथेनॉल को हटाने के लिए इसे लौ करें।
हवा एक ३५ मिलीमीटर संस्कृति पकवान के अंदर एक कोण पर रखकर कवरस्लिप पूरी तरह से सूखी । पॉली-डी-Lysine या पीडीएल, या काम समाधान तैयार करें। प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में पीडीएल लागू करें, किनारों के समाधान के प्रसार से बचें और कमरे के तापमान पर 20 से 30 मिनट के लिए पीडीएल को इनक्यूबेट करें।
सुनिश्चित करें कि पीडीएल सूख नहींता है। पीडीएल को 0.5 मिलीलीटर बाँझ पानी से धोएं और प्लेटों को पूरी तरह से सूखने दें। लैमिनिन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें।
और इसे प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में लागू करें, जिससे किनारों के समाधान के प्रसार से बचना सुनिश्चित हो। दो से छह घंटे तक आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, लेमिनिन समाधान को सुखाने से बचें। प्लेट रेटिना गैंगलियन कोशिकाओं या आरजीसी में भ्रूण विच्छेदन करने के लिए, चार 35 मिलीमीटर ऊतक संस्कृति व्यंजन तैयार और लेबल करें और उन्हें 70% इथेनॉल के चार मिलीलीटर से भरें।
E2 मीडिया एक। E2 मीडिया दो। और E2 मीडिया तीन, विच्छेदन के दिन ।
बर्तन को फ्रिज में रखें। जब जेब्राफिश भ्रूण निषेचन के बाद 34 घंटे होते हैं, तो इनक्यूबेटर से बाहर लेमिनिन के साथ लेपित संस्कृति व्यंजन लें। और 1X पीबीएस के 0.5 मिलीलीटर के साथ तीन बार कवर स्लिप धोएं।
अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक संस्कृति पकवान में ZFCM + मीडिया के चार मिलीलीटर जोड़ें । थाली सुखाने से बचें। तैयार रेफ्रिजरेटेड संस्कृति व्यंजनों को पुनः प्राप्त करें और उन्हें कमरे के तापमान तक बराबरी करें।
ZFCM + मीडिया के 15 माइक्रोलीटर के साथ चार से छह पीसीआर ट्यूब भरें। इनक्यूबेटर से जेब्राफिश भ्रूण को पुनः प्राप्त करें और इसे स्टरलाइज करने के लिए 5-10 सेकंड के लिए 70% इथेनॉल युक्त 35 मिलीमीटर ऊतक संस्कृति पकवान में भ्रूण विसर्जित करें। पिपेट के हस्तांतरण का उपयोग करना, E2 मीडिया एक डिश में भ्रूण स्थानांतरित करना, जिसमें अतिरिक्त इथेनॉल को धोने के लिए बाँझ E2 मीडिया होता है।
फिर, भ्रूण को E2 मीडिया दो डिश में स्थानांतरित करें और तेज संदंश के साथ उनके कोरियोशंस को हटा दें। अंत में, विच्छेदन करने के लिए E2 मीडिया तीन पकवान के लिए भ्रूण हस्तांतरण। एक जोड़ी ठीक संदंश, स्थिति का उपयोग करना और एक संदंश के साथ जर्दी के लिए भ्रूण पूर्वकाल पकड़ो।
और अन्य संदंश के साथ जर्दी थैली के पीछे पूंछ निकालें। संदंश के साथ गर्दन पकड़ो और E2 मीडिया के लिए मस्तिष्क और आंखों का पर्दाफाश करने के लिए सिर से दूर ले। ठीक संदंश की नोक के साथ, धीरे-धीरे सिर से आंखों को रोल करते हुए कपाल ऊतक को दूसरे संदंश के साथ नीचे रखें।
कोशिकाओं को अलग करने के लिए लगभग 45 बार एक p20 पिपेट के साथ ZFCM + धीरे-धीरे ट्राइस्टरेट करने वाली पहले से तैयार ट्यूबों में से एक में चार आंखें स्थानांतरित करें। ZFCM + को अलग कोशिकाओं के साथ कवरस्लिप के केंद्र में स्थानांतरित करें। कंपन को अवशोषित करने के लिए पॉलीस्टीरिन फोम रैक पर 22 डिग्री सेल्सियस पर बेंच टॉप पर संस्कृतियों को बनाए रखें।
इमेजिंग के दिन, आरजीसी अक्षों के विकास को मान्य करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें। लाइव सेल इमेजिंग के लिए, कल्चर डिश से कवरस्लिप को लाइव सेल इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें। एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करें एक डीआईसी उद्देश्य OG-590 Longpass लाल फिल्टर और एक EMCCD कैमरे से लैस है।
इमेजिंग से पहले, जेडएफसीएम + माध्यम को जेडएफसीएम के साथ बदलें - कोशिकाओं को 10X उद्देश्य के साथ स्थिति के बाद, तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके 60X आवर्धन पर छवियां प्राप्त करें। अतिरिक्त 1.5X आवर्धन का उपयोग करें। सबसे पहले डीआईसी छवियों का अधिग्रहण करें।
फिर, उपयुक्त फ़िल्टर सेट का उपयोग करके इमेज roGFP2-Orp1। छवियों का पहला सेट लेने के बाद, विभिन्न उपचार समाधानों वाले मीडिया के साथ मीडिया का आदान-प्रदान करें। पीएच और ऑस्मोलैरिटी परिवर्तन से बचने के लिए मीडिया को इमेजिंग के हर 30 मिनट में बदला जाना चाहिए।
वीवो इमेजिंग में, E3 मीडिया में 22 से 24 घंटे के बाद निषेचन भ्रूण रखें, जिसमें मेथिलीन नीले रंग के बिना 0.003% फिनाइल थिओरिया होता है। मीडिया का आदान-प्रदान करें और मृत भ्रूण को दैनिक रूप से हटा दें। वांछित उम्र में, 1% में एनेस्थेटाइज और माउंट भ्रूण 35 मिलीमीटर ग्लास बॉटम कल्चर व्यंजन पर उठे।
इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्र के आधार पर भ्रूण को पृष्ठीय, वेंट्रेली, या बाद में उन्मुख किया जा सकता है। अगर उठे जमने के बाद, मेथिलीन नीले रंग के बिना E3 मीडिया के साथ व्यंजन भरें, लेकिन 0.016% ट्राइकेन के साथ। इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें।
एक आग्नेय ड्रॉप के तल पर घुड़सवार छवि भ्रूण के लिए एक उल्टे लेजर स्कैनिंग कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। roGFP2-Orp1 उत्तेजित, और वांछित उत्सर्जन फिल्टर के साथ इसी छवियों को प्राप्त करते हैं। भ्रूण के वांछित भाग के माध्यम से पांच माइक्रो मीटर अनुभाग मोटाई के साथ जेड-स्टैक प्राप्त करें।
इमेजिंग के बाद, एगरसे से भ्रूण को ठीक संदंश के साथ हटा दें और उन्हें वांछित उम्र तक फिनाइल थिओरिया के साथ इनक्यूबेटर और मेथिलीन ब्लू फ्री मीडिया में रखें। हाइड्रोजन पेरोक्साइड बायोसेंसर और सुसंस्कृत जेब्राफिश आरजीसी विस्तारित एक्सॉन की एक प्रतिनिधि छवि यहां दिखाई गई है। कोशिका शरीर, अक्षतंश, और विकास शंकु व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं।
संस्कृति मीडिया के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अलावा अनुपात मूल्यों को बढ़ाता है, दिखा रहा है कि वास्तविक समय परिवर्तन इस प्रणाली के साथ पता लगाया जा सकता है । हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर का मात्राकरण पैनल में दिखाया गया है B.To पूरे जेब्राफिश भ्रूण में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर को निर्धारित करते हैं, एमआरएनए को एक सेल चरण के दौरान इंजेक्ट किया गया था, जिससे सभी ऊतकों को roGFP2-Orp1 बायोसेंसर व्यक्त करना पड़ता है। जेब्राफिश लार्वा के प्रमुख क्षेत्र को रेटिना में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के स्तर पर ध्यान केंद्रित करते हुए दो अलग-अलग समय बिंदुओं पर दिखाया गया है।
निषेचन के बाद दो दिन और निषेचन के पांच दिन बाद जेब्राफिश भ्रूण में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के बेसल स्तर को मापा गया । निषेचन के बाद दो दिनों में, अनुपात मूल्य निषेचन के बाद पांच दिनों की तुलना में काफी कम थे । इसके अलावा, प्रत्येक जानवर ने अपने रेटिना हाइड्रोजन पेरोक्साइड सामग्री में वृद्धि का एक अलग स्तर दिखाया।
आंखों को हटाने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करना और पिपेट के साथ आंखों का कोमल विघटन इस प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं। इस प्रोटोकॉल के बाद दवा उपचार के लिए ROS संकेत में शामिल कारकों की जांच की जा सकती है ।
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