In vivo Кальциевая визуализация реакции ганглионных нейронов мыши на вкусовые стимулы

Этот метод может ответить на важные функциональные вопросы о нейронных реакциях на вкус в геникулятных ганглиях, важной части вкусового пути внутренней хорды tympani. Этот метод может быть использован для мониторинга реакций в реальном времени нескольких отдельных нейронов в одном экспериментальном испытании, поскольку клетки, зарегистрированные на животное, значительно выше, чем обычно наблюдается с помощью электрофизиологического метода. С помощью установленной на головном упоре мыши в положении лежа на спине на грелке сделайте двухсантиметровый разрез средней линии в коже над горлом, от грудины до подбородка.

И втянуть кожу и подчелюстные железы, чтобы полностью обнажить дигастрические мышцы. После размещения шва в паратрахеальной мускулатуре отделите шов тупым рассечением и втяните ткань, чтобы открыть его. Осторожно вырежьте отверстие в верхней части трахеи, достаточно большое, чтобы поместить кусок полиэтиленовой трубки, не разрезая более половины диаметра трахеи, и вставьте трубку в трахею по направлению к легким.

Перепозиционирование втягивателей, чтобы освободить паратрахеальную мускулатуру и втянуть подчелюстные железы. Затем используйте небольшое количество ветеринарного клея, чтобы запечатать паратрахеальную мускулатуру вместе над трубкой. Чтобы разорвать тимпаническую буллу, осторожно поддразнивайте нужную дигастрическую мышцу вверх и разтяните соединительную ткань.

Сделайте разрез на переднем конце мышцы, избегая кровеносных сосудов. И оттягивайтесь назад сзади, пока не очиститесь от тимпанической буллы. Слегка наклоните голову назад, чтобы приподнять тимпаническую буллу и найти ветвь сонной артерии с передней к задней точке введения дигастральной мышцы.

Пальпать только по отношению к этому кровеносному сосуду для выпуклой структуры тимпанической буллы и найти шов в мускулатуре. Используя два набора тонких щипцов, тупое рассечение по шву до тех пор, пока не будет видна кость тимпанической буллы, и используйте втягиваятели, чтобы сохранить четкий обзор кости. Найдите шов, идущий с передней на заднюю часть буллы, и используйте хирургический зонд, чтобы проткнуть отверстие в кости в центре шва, затем используйте набор тонких концевых ножниц, чтобы разрезать круглую область в кости, заботясь о том, чтобы не разрезать кровеносные сосуды с передней и задней стороны или ниже буллы.

Чтобы обнажить геникулят, найдите улитку. Перед улиткой находится тензорная мышца. Используйте пружинные ножницы, чтобы разрезать и удалить эту мышцу.

Используйте хирургический зонд, чтобы проткнуть отверстие в кохлеарном мысе и немедленно использовать всасывание, чтобы аспирировать любую жидкость, которая вытекает из отверстия. Увеличьте отверстие в улитке, заботясь о том, чтобы не повредить кровеносный сосуд, окружающий улитку, к заднему и боковому краю. И наклоните голову мыши вперед, чтобы найти отверстие в височной кости под бывшей кохлеарной структурой.

Обратите внимание на гребень, передний к отверстию, который находится непосредственно над седьмым нервом. И вставьте хирургический зонд в отверстие, чтобы позволить височной кости быть осторожно поднятой, чтобы обнажить седьмой нерв. Если геникулят не полностью виден, осторожно наклоните голову животного назад и попытайтесь подтянуть кость с передней части нерва.

Если ганглии все еще скрыты, вытяните больше кости снизу, заботясь о том, чтобы не поместить зонд глубоко под кость, так как это может повредить геникулят. Чтобы запустить панель tastant, используйте всасывание, чтобы удалить жидкость из-за геникулята и поместите мышь на абсорбирующую прокладку под рассекающим микроскопом. Используйте отверстие, оставленное в булле, отверстие в височной кости и седьмой нерв, чтобы найти геникулированный ганглий.

И используйте фильтр FITCGFP на эпифлуоресцентной области для проверки отдельных GCaMP-экспрессирующих геникулятных ганглийных нейронов. Поместите дозировочную иглу для одной линии вкуса крепко в рот животного и поместите чашку Петри под рот, чтобы поймать любую жидкость. Синхронизируйте начало видеозаписи с началом презентации, просматривая прямую трансляцию для ответов, дрейфа и просачивания во время записи.

Если происходит просачивание, всасывайте жидкость до тех пор, пока вид геникулята не будет ясным, и повторно доставляйте вкус. Если происходит дрейф, проверьте, что все части головного упора прочно затянуты. Если ответа не происходит, проверьте, что жидкость течет и что микроскоп и камера сфокусированы на правильном месте, не скрывая ничего, что заслоняет поле зрения.

Когда все желаемые эксперименты будут завершены, осторожно облегчите втягиватели и повторите экспозицию и вкусный анализ на противоположной стороне животного. Как уже отмечалось, вкусовые стимулы, применяемые к языку, должны приводить к быстрому преходящей увеличению флуоресценции GCaMP, вызывая заметное изменение яркости среди реагирующих нейронов. Анализ флуоресцентных видеоматериалов позволяет создавать следы, соответствующие изменениям флуоресценции по сравнению с исходным откликом в отдельных областях, представляющих интерес с течением времени.

Изменение интенсивности флуоресценции выше порогового уровня считается положительным ответом. Помимо повреждения ганглия, важно избегать кровотечений. Если происходит кровотечение, подождите, пока кровь сгустится, прежде чем применять физиологический раствор и всасывание, чтобы удалить кровь из поля зрения.

Визуализация геникулятных ганглиев позволила исследователям напрямую измерить реакцию нейронов на вкусовые стимулы и идентифицировать эти нейроны с помощью таких инструментов, как Cre-зависимый GCaMP.