Biology
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In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato
Chapters
Summary July 28th, 2021
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Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.
Transcript
Este método permite a visualização em tempo real de diferentes eventos, ocorrendo na medula óssea do rato do crânio, como megacariócitos, estendendo proplatelets dentro dos vasos sinusoides. A principal vantagem dessa técnica é uma pequena cirurgia necessária para minimizar a reação inflamatória, permitindo uma visualização in vivo de eventos em condições quase de fábrica. Para começar, transporte o rato para a sala de imagens.
Ligue o microscópio e o computador e configure os parâmetros necessários. Uma vez que o mouse tenha colocado completamente anestesiado o mouse em uma placa aquecida, aquecido a 37 graus Celsius para todas as manipulações seguintes, raspe a cabeça e a garganta do mouse e aplique o gel nos olhos para evitar o ressecamento. Coloque o mouse de costas e conserte as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta.
Depois de desinfetar a garganta, faça uma incisão de 0,7 a 1 centímetro sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura e estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia malabarista externa em cima do músculo peitoral. Encha o cateter com soro fisiológico quente e estéril. Penetre o cateter através do músculo peitoral e, em seguida, insira o cateter na veia.
Retire suavemente a agulha, conecte a seringa com os rastreadores fluorescentes e injete o volume morto do cateter. Coloque uma gota de cola cirúrgica para estabilizar o cateter. Retorne cuidadosamente o mouse para uma posição propensa.
Desinfete o couro cabeludo com 70% de etanol com uma toalha de papel enquanto remove os cabelos soltos. Use tesouras finas estéreis e pinças para fazer uma incisão em forma de T na linha média até um centímetro entre as orelhas no couro cabeludo para expor o calvario. Exponha o crânio com pinças, depois use tesouras e pinças para remover cuidadosamente o periósteo.
Use um cotonete estéril encharcado e fisiológico para remover todo o periósteo e quaisquer detritos ou cabelos que possam alterar a imagem. Enxágüe o crânio com soro fisiológico para remover quaisquer vestígios sanguíneos e seque rapidamente o osso com um cotonete. Aplique o gel de cola no anel, coloque o anel no osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para permitir que o anel se apegue firmemente ao crânio.
Umedeça levemente o crânio com um cotonete de algodão salino. Prepare a pasta dentária de Silício misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo em uma proporção de um para um. Sele o anel aplicando a pasta dentária para evitar vazamentos durante a imagem.
Remova cuidadosamente qualquer pasta dentária ou cola que possa ter entrado no anel. Em seguida, encha o anel com soro fisiológico para verificar o vazamento. Coloque o mouse no suporte e coloque uma compressa dobrada sob a cabeça do animal para levantar a cabeça e evitar o descolamento do anel do crânio quando ligado ao suporte.
Dane-se o anel no suporte do bloco. Coloque o suporte e o conjunto do mouse na câmara de microscópio aquecido. Defina os comprimentos de onda laser apropriados para os quatro quatros escolhidos e a recuperação das luzes emitidas.
Utilizando o cateter inter malabarista injete 50 microliters de 0,2 solução micromolar do rastreador fluorescente para rotular a vasculatura. Coloque o estágio do microscópio com o suporte e o mouse sob o objetivo do microscópio. Certifique-se de que o anel está sempre cheio de soro fisiológico e recarrenchá-lo, se necessário, e imergir o objetivo e soro fisiológico.
Use epifluorescência para localizar os vasos de medula óssea e observar os megacaiócitos alinhados ao longo dos vasos sinusoides. Para aquisições longas, configure uma aquisição 3D espaço-tempo com uma imagem de 384 por 384 pixels usando um scanner de ressonância Hertz de oito quilos e modo bidirecional. Use a linha média com boa resolução, em seguida, escolha o tamanho otimizado de etapa Z e configure o intervalo de tempo necessário antes de iniciar a aquisição.
Para aquisições curtas e rápidas, escolha um espaço, tipo de aquisição de tempo e minimize o tamanho da imagem. Se necessário, ajuste a imagem para a nave girando o campo de imagem. Use a maior velocidade de varredura disponível e digitalização bidirecional.
Minimize a média da linha para encontrar o compromisso ideal entre definição de imagem e rapidez da aquisição. Adquira apenas um plano Z e minimize o intervalo de tempo para aquisição. Para medir a velocidade plaqueta de 10 a 20 segundos de aquisição deve ser suficiente.
O rastreador fluorescente foi administrado por via intravenosa à imagem dos vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio, com a direção de fluxo representada pela seta. A velocidade da plaqueta fluorescente foi registrada em cada ramo do vaso, e a variação foi observada. Os vasos sinusoides apresentam fluxos complexos devido aos anastomoses, com a presença de refluxo de fluxo e até estase.
Setas indicavam a direção oposta do fluxo na bifurcação. A velocidade da plaqueta também foi medida para os ramos da embarcação esquerda e direita indicaram irregularidade ao longo do tempo em cada ramo da embarcação com fases de aceleração, estase e desaceleração. Diferentes morfologias de proplatelets foram observadas, incluindo proplatelets com margens irregulares, em seguida, en proplatelets longos e proplatelets grossas e curtas.
Quando os megacaiócitos estenderam as propuladas nas áreas de fluxos complexos, os propulados lançam de um ramo de navio para o outro, de acordo com a direção de fluxo. Ao parar o fluxo sanguíneo, as propuladas relaxaram e o camundongo inesperadamente sofreu parada cardíaca, indicando a importância das forças hidrodinâmicas no alongamento proplatelet. A largura e o comprimento dos proplatelets também foram medidos com largura média de 5,2 micrômetros e observou-se um comprimento máximo médio de aproximadamente 185 micrômetros.
Traçar o comprimento proplatelet em função do tempo permite a visualização do comportamento dos proplatelets durante fases de alongamento, estase ou até mesmo retração. Observou-se a velocidade média de alongamento de aproximadamente 10 micrômetros por minuto. A instalação do cateter permitiu a injeção de medicamentos para estudar os efeitos na formação de proplatelets ou outros eventos de interesse em tempo real.
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