吸收荧光标记的小细胞外囊泡 在体外 和脊髓

通过脊髓中的不同细胞可视化地吸收小细胞外囊泡（也称为 SEV），可以确认 SEV 的成功交付。这使得机械和治疗研究的内部管理SEV从各种来源在罗登模型。此协议可用于可视化轻度脊髓中细胞吸收的 SEV，并有助于评估 SEV 及其货物分子在脊柱疾病、疼痛和炎症中的作用。

这个程序将由我和宣罗和林竹成博士的两名研究生在西娜·阿吉特博士的实验室里演示。首先在12个井板中放置18毫米盖滑，然后在每个井中放置神经-2a细胞，总共1毫升完整的DMEM，含有10%FBS和1%笔链球菌。当细胞计数流利度达到 80 到 90% 时，将介质更改为 DMEM 外体耗尽介质，在每口井中加入一、5 或 10 微克标记的 SEV。

1、4 和 24 小时。对于剂量和时间取决于以同等数量的染料控制吸收到其余油井。收集产后幼崽的大脑在60毫米，培养皿含有冰冷汉克斯平衡盐溶液补充10毫摩尔疱疹，解剖皮质叶和去除脑膜。

然后用消毒刀片切碎纸巾。将组织转移到一个15毫升的锥形管中，其中含有Pepane或脱氧核糖核酸一个分离缓冲器，在37摄氏度下孵育20分钟，每5分钟旋转一次管子，吸气超纳特，并在管中加入5毫升完整的DMEM。要灭活酶活性，请尝试仔细评分，用 5 毫升玻璃血清移液器和火焰抛光牧场移液器分离组织。

通过40微米的细胞过滤器传递细胞悬浮，然后在250倍G下离心细胞5分钟，在4摄氏度下吸气介质，在75平方厘米的烧瓶中看到10毫升完整的DMEM细胞。经过4个小时的电镀，用15毫升的新鲜DMEM介质代替超年和介质。在体外分离微胶质和寡头细胞14天后，将烧瓶以320 RPM转入轨道摇床6小时。

在37摄氏度下使用5毫升的细胞分离酶10分钟。要使剩余的星形细胞跳动，以灭活酶作用，添加5毫升的完整DMEM，然后在4摄氏度下以250倍G的G颗粒细胞5分钟。将细胞重新悬念在完整的 DMEM 中，并在 24 井板中查看 12 毫米编号 1.5 盖滑的细胞。

使用 PBS 冲洗细胞 3 次，然后在 PBS 中用 4% 功率的甲醛或 PFA 在室温下修复 10 分钟。用 PBS 清洗固定电池 3 次 5 分钟，然后在 PBS 中使用 0.1%Triton X 100 将固定电池渗透 10 到 15 分钟。然后用 PBS 重复洗涤。

在室温下，在PBS中使用5%的正常山羊血清或NGS1小时来阻断细胞，用地图双向抗体孵育神经-2a细胞，在4摄氏度的新鲜5%NGS或PBS中，以1~500的比例在GFAP抗体中孕育主要星形细胞，轻轻摇晃。在 PBS 中清洗细胞 3 次后，在 5%NGS 中加入氟酚结合的二次抗体。在室温下孵育2小时，不受摇动器上的光线影响。

用PBS重复洗涤，在室温下用每毫升1微克的DAPI孵育细胞10分钟。再次，用PBS清洗细胞3次。使用防褪色安装介质，将盖片安装在 1 号滑梯上，让它们在黑暗中干燥过夜，并将准备好的玻璃滑梯存储在 4 摄氏度下，直到在共聚焦显微镜上成像。

解剖脊髓，并在PBS的4%PFA中固定在4摄氏度下24小时。之前在PBS中保护30%蔗糖中的组织在4摄氏度下24小时，或直到组织下沉，然后将组织储存在4摄氏度，直到免疫造血，在OCT化合物中嵌入L4 L5脊髓，然后将其冻结在干冰上，直到完全凝固。使用低温统计器在 30 微米处分割组织，并将部分收集到包含 PBS 的 24 井板中。

在 PBS 中用 0.3% Triton 分别清洗 3 次 5 分钟，在室温下使用 0.3% Triton PBS 中的 5%MGS 阻止非特定绑定站点 2 小时。在摇床上将部分在 4 摄氏度下孵化过夜。用 Pbs 中的 0.3% Triton 洗 3 次 5 分钟。

然后添加二级抗体的适当浓度。根据文本手稿，在室温下孵育两小时，仅使用PBS清洗部分，并在室温下以每毫升1微克的DAPI孵育1微克，10分钟。然后在光显微镜下重复 PBS 洗涤，用细漆刷将部分安装在透明胶粘剂滑梯上。

用安装介质弄湿盖滑，在室温下在黑暗中过夜，用相应的激光在共聚焦显微镜下获取图像，RA 2 6 4 0.7 派生SEV的平均平均尺寸为140纳米，峰值粒子大小为121.8纳米。最可探测的粒子属于外显子或 SEVS 的大小范围。在50至150纳米的西式SEV、细胞裂解和外耗介质的西面印迹中，证明SEV衍生蛋白样本中含有SEV标记蛋白阿利克斯CD81和GAPDH。

细胞解质富含内质球菌，常驻蛋白卡内辛因此卡内辛作为细胞污染的阴性标记，因为它在SEV中不存在。观察到，SEV 的吸收发生在 1 小时，对于 1、5 和 10 微克 SEV，在 4 小时内可以检测到孵化后荧光，用于 4、5 和 10 微克 SEV。对原发性星细胞吸收PKH 26标记的SEV进行了检查，在24小时内对原皮质星核细胞的SEVS吸收的最大荧光进行了检查，并在6小时内观察到最大荧光，在神经元星细胞和微胶质细胞中进行了注射后的最大荧光。

包括控制，无标签的SEV和染料控制，它创造了代码的风假阳性最近信号，由于现在特定的标签Opry舞蹈未绑定染料补丁海岸。通过研究生物分子货物转移到配方、细胞和组织，并确定生物分子或目标基因表达水平的变化，可以证实 seV 的吸收。也可以进行行为研究，以调查 SEV 交付的功能影响。