Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hartsassisterad fångst i kombination med isobar tandemmassetikettmärkning för multiplexerad kvantifiering av proteintioloxidation
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Proteintioloxidation har betydande konsekvenser under normala fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Vi beskriver detaljerna i en kvantitativ redoxproteomikmetod, som använder hartsassisterad infångning, isobarisk märkning och masspektrometri, vilket möjliggör platsspecifik identifiering och kvantifiering av reversibelt oxiderade cysteinrester av proteiner.
Transcript
Detta protokoll beskriver en metod som möjliggör platsspecifik identifiering av oxiderade cystinrester av proteiner. Metoden gör det möjligt att generera kvantitativa och platsspecifika data av oxiderade cystinrester från olika provtyper. För att påbörja det assisterade infångningsförfarandet, tvätta de utfällda proteinpelletsna två gånger med aceton genom att centrifugera vid 20 500 G, i fyra grader Celsius i 10 minuter.
Dekantera sedan acetonen och ta bort den återstående acetonen med en mikropipett. Använd en serologisk glaspipett tillsätt tre milliliter färsk iskall aceton till röret och blanda väl genom att invertera röret flera gånger. Efter den andra tvätten, låt pelletsna lufttorka i en till två minuter utan att låta dem torka.
Tillsätt en milliliter buffert B till den torkade proteinpelleten. För att solubilisera proteinet, sonikera pelleten upprepade gånger i en bad sonicator med en utgång på 250 watt för 15 till 30 sekunder åt gången, tillsammans med kort virvel. Utför Bicinchoninic acid eller BCA-analysen för att mäta proteinkoncentrationen.
För att standardisera proteinkoncentrationerna, överför 500 mikrogram proteinprov till ett centrifugalfilter på 0,5 ml 10 kilodalton och volym upp provet till 500 mikroliter med resuspensionsbuffert. Centrifugera proteinbuffertblandningen vid 14 000 G i rumstemperatur tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 mikroliter. Samla provet genom att invertera filtret i ett uppsamlingsrör.
Centrifugera provet vid 1000 G i två minuter och tillsätt buffert C för att få en slutlig volym på 500 mikroliter. För att minska proteintiolerna, tillsätt 20 mikroliter 500 millimolar ditiotreitol eller DTT till provet för att få en slutlig koncentration av 20 millimolar och inkubera proverna i 30 minuter vid 37 grader Celsius med skakning vid 850 rpm. Efter reduktion, centrifugera till proverna i 0,5 ml 10 kilodalton centrifugalfilter vid 14 000 G vid rumstemperatur tills volymen i centrifugalfiltret är mindre än 100 mikroliter.
Tillsätt buffert D för att öka volymen till 500 mikroliter och upprepa centrifugeringen. Efter den fjärde centrifugeringen samlar du upp proverna genom att invertera filtret i ett uppsamlingsrör för att centrifugera vid 1000 G i två minuter. Mät sedan proteinkoncentrationen med hjälp av BCA-analysen.
Placera sedan spinnkolonnerna på ett vakuumgrenrör och överför 500 mikroliter av den nyberedda tiolaffinitetsuppslamningen till varje kolonn med hjälp av en mikropipett. Applicera vakuum för avlägsnande av vatten. Upprepa proceduren en gång för att erhålla 30 milligram harts per kolonn.
Tvätta hartset fem gånger med 500 mikroliter ultrarent vatten, genom att applicera ett vakuum för att avlägsna vattnet och sedan fem gånger med 500 mikroliter buffert E.In ett nytt rör, tillsätt buffert C till 150 mikrogram av det reducerade proteinprovet tills den slutliga volymen är 120 mikroliter. Överför proteinlösningen till en pluggad spinnkolonn som innehåller hartset. Placera locket på kolonnen och inkubera i två timmar vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm.
Tvätta hartset enligt beskrivningen i manuskriptet. Sätt tillbaka kontakten. För att utföra på-hartstryptisk matsmältning, tillsätt 120 mikroliter nyberedd trypsinlösning till proverna och inkubera kolonnen över natten vid 37 grader Celsius, med skakning vid 850 rpm.
Nästa dag, tvätta hartset flera gånger enligt beskrivningen i manuskriptet och sätt tillbaka kontakten. Använd en mikropipett och tillsätt 40 mikroliter 100 millimolar Triethylammonium-bikarbonatbuffert till det tvättade hartset. Tillsätt sedan 70 mikroliter av den upplösta tandemmasstaggen eller TMT-märkningsreagenset och inkubera i en timme vid rumstemperatur med skakning vid 850 rpm.
Förvara eventuellt kvarvarande TMT-reagens vid minus 80 grader Celsius. Tvätta hartset och sätt tillbaka kontakten. Eluera de TMT-märkta peptiderna genom att tillsätta 100 mikroliter 100 millimolar ammoniumbikarbonatbuffert vid pH 8,0, innehållande 20 millimolar DTT, till kolonnen och inkubera kolonnen på en termisk mixer vid rumstemperatur i 30 minuter vid 850 rpm.
Efter inkubation, utför eluering genom att placera kolonnen på ett vakuumgrenrör, applicera vakuumet och eluera proverna i ett fem milliliter mikrocentrifugrör. Upprepa steget en gång och tillsätt sedan 100 mikroliter 80% acetonitril med 0,1% trifluorättiksyra till kolonnen. Efter inkubering av kolonnen i 10 minuter vid rumstemperatur, eluera provet i samma fem milliliter centrifugrör.
Placera de eluterade proverna i ett vakuumkoncentrator tills det är torrt. Förvara sedan de torra peptiderna vid minus 80 grader Celsius tills vidare användning. Den kvalitativa analysen av peptidprover från RAW 264.7-celler utfördes med SDS-PAGE, där prover jämfördes genom att bestämma olika nivåer av oxidation på grund av behandlingar.
De separerade proteinerna undersöktes därefter av western blot för att ytterligare undersöka oxidationsnivåerna för enskilda proteiner. Rapporterade jonintensiteter av cystininnehållande peptider analyserades med vätskekromatografi tandemmasspektrometri. Tioloxidationsstökiometrin av iTRAQ, märkt berikade och oxiderade peptider vid individuella cystinnivånivåer kvantifierades.
Ta försiktigt bort aceton utan att störa proteinpelleten. Se till att proteinpelleten är helt solubiliserad och kvantifierad exakt, och att hartset är korrekt allokerat till spinnkolonner. Var noga med att återsuspendera harts under tvättstegen.
Ytterligare utvärdering av berikade proteiner och peptider kan utföras med SDS-PAGE och färgning, western blotting och masspektrometri.
Tags
Biokemi utgåva 172 RAC TMT tiol redoxproteomik cystein PTM stökiometri redoxmodifieringarRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
