Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation
Chapters
Summary August 21st, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kvantitativ multiplex immunoprecipitation (QMI) använder flödescytometri för känslig detektion av skillnader i överflödet av riktade protein-protein interaktioner mellan två prover. QMI kan utföras med en liten mängd biomaterial, kräver inte genetiskt modifierade taggar, och kan anpassas för alla tidigare definierade protein interaktion nätverk.
Transcript
Kvantitativa multiplexed co-immunoprecipitation, eller QMI, gör det möjligt för användare att samtidigt mäta hundratals binära interaktioner i ett fördefinierat nätverk för proteininteraktion. Genom att utföra flera co-IPs samtidigt i samma lysate, bioinformatik tekniker kan sedan undersöka hur grupper av co-föreningar förändras på ett samordnat sätt. Analysen är tidskrävande att utveckla, men när QMI panelen är i handnät skala data kan samlas in om signaltransduktion system i en relativt enkelt övernattning analys.
QMI kräver noggrann pipettering av olika prover och reagenser till 96 brunnsplattor. Noggranna anteckningar bör tas när du ställer upp och kör varje analys för att förhindra fel. För provberedning och immunoprecipitation, börja med att provet i ett lämpligt rengöringsmedel med proteas och fosfatashämmande medel lysning under en 15 minuters inkubation på is kan sänkas.
I slutet av inkubationen, snurra ner provet för att avlägsna membranen och skräp och utföra en BCA-analys på supernatanten för att bestämma proteinkoncentrationen enligt standardprotokoll. Efter att ha normaliserat proteinkoncentrationerna, förbered en magnetisk pärlmästarblandning som innehåller cirka 250 magnetiska pärlor av varje klass per brunn. Använd magnetisk separation för att tvätta den magnetiska pärlan blanda två gånger i Fly P buffert innan resuspending pärlorna i 20 mikroliter av Fly P buffert per prov.
Efter en grundlig pipettering, alikvoter 20 mikroliter av pärlor i en iskall microcentrifug röret per prov och lägga till lika volymer av lysate med normaliserade protein koncentrationer till varje rör för immunoprecipitation. Dela sedan varje lysateprov i ett rör för varje platta som körs och immunprecipitate proverna på en rotator vid fyra grader Celsius över natten skyddas från ljus. Nästa morgon använder en magnetisk pärla rack för att ta bort lysate från den första uppsättningen av rör och tvätta pärlor två gånger i 500 mikroliter iskall Fly P buffert per tvätt.
Efter beräkning av resuspension-volymen, återanvänd immunfällorna i den beräknade volymen av iskall Fly P buffert. Grundligt resuspend de magnetiska pärlorna genom mild pipettering och distribuera 25 mikroliter av pärlor per brunn över en platt bottnad 96 väl platta på is. I en annan 96 brunnsplatta, späd genom attinilated sond antikroppar mot en två gånger arbetskoncentration.
Använd en flerkanalig pipett för att fördela 25 mikroliter av varje sondantikroppsutspädning i lämpliga brunnar i den magnetiska pärlan som innehåller analysplatta och skaka med hög hastighet på en horisontell plåtskakre för att blanda och resuspend de magnetiska pärlorna. Efter blandning, minska hastigheten för en timmes inkubation vid fyra grader Celsius skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan tre gånger med färsk Fly P buffert per tvätt på en magnetisk tallrik bricka bricka vid fyra grader Celsius.
Efter den sista tvätten, resuspend pärlorna i 50 mikroliter av streptavidin PE utspädd en till 200 i Fly P buffert. Skaka blandningen och resuspend pärlorna innan inkubera plattan i fyra grader Celsius i 30 minuter skyddas från ljus. Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan tre gånger med Fly P buffert på en magnetisk tallrik bricka på fyra grader Celsius och återanvänder pärlorna i 125 mikroliter av Fly P buffert.
Skaka plattan i en minut vid 900 rotationer för att grundligt resuspend pärlorna och ladda plattan i en refridgerated flöde cytometer. I programvaran flödescytmeter väljer du inställning för hög RP1-mål, ett stoppvillkor på 1, 000 pärlor per region och en provvolym på 80 mikroliter. Pausa körningen halvvägs igenom och resuspend pärlorna för att förhindra att lösa.
I slutet av körningen exporterar du datafilerna i XML-formatet. För att utföra ANC-analys, fyll i ANC-indatafilen för att återspegla detaljerna i den experimentella designen och köra programmet, som kommer att skriva en CSV-fil i den aktiva katalogen. Filen som slutar i träffar.
CSV kommer att rapportera de medföreningar för protein som är väsentligt olika på en falsk positiv nivå på 0,05 mellan kontroll- och experimentförhållandena i minst tre av fyra experimentella replikat. För viktad korrelationsnätverksanalys klistrar du in kolumntitlarna för datafilsutdata genom att Matlab slutar på mfi. CSV i den första kolumnen i ett nytt kalkylblad och lägga kolumnerna Experiment för experiment nummer och Behandling för experimentell behandling och eventuella andra variabler som skall analyseras.
Spara den här filen som egenskaper. CSV och öppna R Studio. Ställ in arbetskatalogen till en mapp som innehåller mfi.
CSV och egenskaper. CSV-filer, markera avsnitt av kod och slå Kommando Enter för att köra R-kommandona som anges i den kommenterade Kommandofilen. De viktade korrelationsnätverksanalysmodulerna korrelerade avsevärt med varje experimentell egenskap kommer att vara utdata som en grafisk fil och korrelationen av varje interaktion med varje modul kommer att vara utdata som en CSV-fil.
För varje interaktion i ANC-utdatafilen, identifiera om den interaktionen är också signifikant av CNA och skapa en ny kolumn som anger om varje ANC-träff också är en CNA-träff. Konvertera värdena till logg två gånger förändring och beräkna det genomsnittliga värdet för alla ANC union CNA träffar. Slutligen, gör ett nytt kalkylblad med varje ANC-union CNA hit som anges av dess immunprecipitationsmål i en kolumn, dess sondmål i den andra kolumnen och dess vikningsförändringsvärde i den tredje kolumnen.
Importera den här filen till Cytoscape som ett nätverk för att skapa ett nodkantsdiagram. Hög konfidens protein interaktioner identifieras av de två oberoende statistiska tillvägagångssätt visualiseras som nod kantdiagram med hjälp av öppen källkod, Cytoscape, eller som heatmaps med hjälp av R-kod och analysanvisningar som ingår i det kompletterande materialet. Under hela protokollet, användare måste ta hand om att pipettera exakt, att hålla noggranna register, och att hålla proverna kalla hela tiden.
Vi har använt QMI för att förstå hur signaltransduktionsvägar skiljer mellan olika indatatyper och integrerar information från flera receptorer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
