Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים
Chapters
Summary July 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.
Transcript
בנינו בחינה הומוגנית המבוססת על חרוזים כדי לחקור אינטראקציות בין מלווה לקוצ'מלון. באמצעות טכניקה זו, אנו מסננים מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- FKDP51 או FKBP52 ומזהות מעכבים חזקים וסלקטיביים. טכניקת סינון תפוקה גבוהה זו היא חזקה ואמינה.
התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, וזה דורש רק כמויות קטנות של חלבון חרוזים ותרכובות. אינטראקציה Hsp90 עם cochaperones זה היה מעורב בהפרעות אנושיות, כגון מחלת אלצהיימר, סרטן, מחלה אוטואימונית. טכניקה זו מספקת את ההזדמנות לסנן מעכבי cochaperone מלווה עם חשיבות רפואית גבוהה.
הנה העיקרון הבסיסי של ההסתה הזאת. כאשר האינטראקציה בין Hsp90C-Terminal פפטיד לתחום TPR של cochaperones מביא את התורם ואת חרוזים הקבלה לקרבה, אות מוגבר מאוד נוצר. כאשר מעכבי האינטראקציה מתווספים, התורם וחרוזים מקבלים לא יכולים להגיע לקרבה, ולא מיוצר אות לגילוי.
התחל על ידי דילול פפטיד Hsp90 ב- PBS בריכוז מיליגרם אחד למיליליטר. לדלל את חרוזי הקבלה ללא מנונים ב- PBS, ולהעביר את החרוזים לתוך צינור 1.5 מיליליטר. צנטריפוגות החרוזים מדוללים לשטיפה, ולאחר מכן להסיר בזהירות את supernatant.
להטיות, הגדר את חרוזי הקבלה בפפטידים ביחס של 10 ל -1. לחרוזים הפאלטיד בפפטיד מדולל PBS, פתרון Tween 20 ונתרן ציאנבורוהידריד, ודגרו עם תסיסה מקצה לקצה על שייקר סיבובי. כדי לחסום את האתרים שלא נפרעו, להוסיף 20 microliters של פתרון הידרוכלוריד טוחנת אחת של pH 8.0 לחרוזים, ולהרוות את התגובה על ידי דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לשטוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולה חרוזים במיליליטר אחד של פתרון טריס הידרוכלוריד. חזור על הכביסה פעמיים נוספות. לאחר הכביסה האחרונה, להשעות מחדש את החרוזים בריכוז מיליגרם אחד למיליליטר במאגר אחסון ולאחסן את פתרון חרוז הקבלה מצומד ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
הוסף חרוזי תורם גלוטתיון בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS. הוסף GSTFKBP51 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ודגר את התגובה במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס בחושך. הפוך דילול טורי של תרכובת הבדיקה ב- DMSO.
מוסיפים 0.25 מיקרוליטרים של דילול תרכובת בדיקה ומשולשים בפינה של כל באר של צלחת 384 באר. לשליטה שלילית, הוסיפו 0.25 מיקרוליטרים של DMSO ולשליטה חיובית, הוסיפו 0.25 מיקרוליטרים של פפטיד Hsp90 C-Terminal בבארות. הוסיפו 22.5 מיקרוליטרים של הפתרון המכיל חרוזי תורם גלוטתיון עם חלבונים מתויגים GST לכל באר.
לנער את הצלחת ביסודיות עם הידיים ודגרה בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לדלל את החרוזים הקבלה עם פפטיד Hsp90C-Terminal המצורפת ל 100 מיקרוגרם לריכוז מיליליטר בריכוז של פי 0.5 PBS. הוסיפו 2.25 מיקרוליטרים של חרוזי קבלה מדוללים לכל באר.
לנער ולדגירה את הצלחת בחושך במשך 15 דקות כפי שהוכח. הפעל את כלי קורא הלוחות, מדוד את האות של הצלחת וניתח את הנתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט. צור טבלת נתונים X-Y בתיבת הדו-שיח של הפתיחה, בחר מספרי X, Y והזן שלושה ערכים משוכפלים בעמודות זו לצד זו.
ייבא את ערכי הריכוז לעמודת X וערכי האות לעמודה Y. לחץ על נתח, בחר שינוי צורה בריכוז X ולאחר מכן בחר המרה ללוגריתמים. לחץ על נתח ובחר רגרסיה לא ליניארית תחת ניתוח X-Y.
פתח את אפשרות עיכוב תגובת המינון ובחר יומן רישום לעומת משוואת שיפוע משתנה תגובה. לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות המכילות ערך IC50 וגרפים. בדיקה זו שימשה להקרנת מולקולות קטנות, עיכוב אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.
ציון Z של יותר מ- 0.8 ויחס איתות לרקע של 13.35, מדגימים את החוסן והאמינות להקרנת תפוקה גבוהה. ההשפעה של תרכובת בדיקת משקל מולקולרית קטנה D10 על עיכוב של אינטראקציות cochaperone מלווה הוערך וערכי IC50 חושבו, שם D10 הראה עיכוב תלוי מינון. ערך IC50 עבור אינטראקציות Hsp90 GSTFKBP51 היה 65 ננומולר.
בעוד שעבור Hsp90, אינטראקציות GSTFKBP52, עיכוב מלא לא הושג עם הריכוז המורכב הגבוה ביותר מציין כי עיכוב סלקטיבי של אינטראקציה חלבון חלבון עם מולקולות קטנות ניתן להשיג. השלב הקריטי הוא סדר התוספת. ראשית אנו יוצרים קומפלקס בין מולקולה קטנה לבין יעד ה-TPR שלה.
אחרת נדרשים דגירה ארוכה יותר וריכוזים מורכבים גבוהים יותר. אנו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות המשבשות את האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKB51 או Hsp90 ו- FKB52. זה יכול גם להיות מורחב לכל אינטראקציה בין Hsp90, Hsp70 ומוטיב TPR המכיל מעכבי סלקטיביים הקרנת cochaperone.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
