通过电子断层扫描对超构造保存的染色质中的复制结构域进行成像

我们提出了一种方案，通过EdU标记新合成的DNA和标记检测，通过纳米金颗粒的银增强和染色质的ChromEM染色进行标记检测，对细胞中的复制域进行电子显微镜可视化。该方案使高对比度的预包埋标记与传统的戊二醛固定，为室温样品处理提供了染色质的最佳结构保存。该方案针对生长在培养皿中盖玻片上的粘附细胞进行了优化。

将EdU加入10微摩尔终浓度，并将细胞放入培养箱中以达到所需的标记时间。用2.5%葡萄糖醛酸酐在100毫摩尔二甲酸钠溶液中固定标记的细胞一小时。较长的固定时间可能会对EdU标记产生不利影响。

通过用补充五毫摩尔氯化镁的PBS冲洗样品来去除戊二醛，进一步被视为PBS星。洗涤三次，每次 10 分钟。在PBS星中用1%的Trione X-100溶液渗透质膜，每次进行两次更改，每次五分钟。

这种溶液又称PBS星T.用PBS星光广泛洗涤样品。五次更改，每次五分钟。用PBS星中20毫摩尔甘氨酸淬灭残留的醛基，两次10分钟。

将样品置于PBS星光中，含1%BSA，持续半小时。在BSA中阻断时，准备用于EdU检测的反应鸡尾酒。组件添加的顺序很重要。

EdU生物素 - 叠氮化物偶联在潮湿的腔室中进行，以最大限度地减少反应混合物中的蒸发和浓度变化。准备潮湿的腔室。将盖玻片放在对映膜上，使细胞朝上，并将50至100微升的反应混合物层到盖玻片上。

室温下反应需要30分钟。通过在PBS星T中洗涤样品来停止反应，每次五次，每次五分钟。在PBS明星T中再次用1%BSA阻止半小时。

在PBS星T中制备链霉亲和素 - 纳米金溶液与1%BSA。将样品与链霉亲和素在新制备的潮湿室中以加四度孵育过夜。该过程与EdU生物素 - 叠氮化物偶联相同。

停止反应并洗涤样品，每次5次，每次10分钟，每片用PBS星T.稳定生物素链霉亲和素复合物，通过另外固定将1%戊二醛PBS星形固定半小时。用去离子水强洗，去除戊二醛。用每毫升一毫克硼氢化钠淬灭残余醛基。

再次彻底清洗。下一步是通过在黄金路线上沉积银来增加纳米金颗粒的尺寸。准备预混料以最大限度地减少暗室活动。

用洗涤缓冲液平衡样品并进入暗室。在暗室中混合组分以制备洗涤溶液并将其应用于样品。金合欢粉溶液是高度粘稠的。

因此，在混合组分时，慢慢摇动管子，以避免气泡和泡沫的形成。反应需要两到五分钟。我们建议执行测试运行以确定最佳反应时间。

较长的孵育时间可能导致非特异性银沉积。为了停止反应，用三到五次变化的去离子水快速冲洗样品。随后再进行三次更改，每次更改五分钟。

为了保护银纳米颗粒不被四氧化锇溶解，将样品在0.05%四氯金酸中在黑暗中孵育两分钟。用去离子水彻底清洗。在此阶段，向含有DNA的材料添加额外的对比度。

用DRAQ5 DNA染色剂浸透样品。向样品中加入二氨基联苯胺溶液并孵育一分钟。将盖玻片移入玻璃底培养皿中，并将其放在倒置显微镜的载物台上。

用640纳米红光照射多个视场。左侧面板显示了 DRAQ5 的完整照片漂白。在右侧面板上，相同的视场在显示DAB沉淀物的透射光中成像。

用去离子水洗涤样品。下一阶段应在通风橱下进行。制备部分还原的四氧化锇溶液。

小心。该物质具有高挥发性和毒性。将准备好的溶液涂在样品上。

在此阶段，还原的锇化合物与二氨基联苯胺沉积反应并增加DNA的对比度。根据您当地的法规处理含锇溶液，并清洗样品三次，每次五分钟。样品在一系列增加的乙醇浓度中进一步脱水，然后用乙醇树脂混合物浸润细胞。

用新鲜制备的纯树脂代替醇树脂混合物。用新鲜制备的树脂填充适当尺寸的包埋模具。将盖玻片与一个细胞面朝下放在树脂填充的腔体上。

树脂在37度下固化24小时。然后在60度下至少两天。从盖子的底面上取下树脂。

将板坯放入液氮中，然后转移到沸水中。玻璃应分离。如果需要，可重复上述步骤。

由于二氨基联苯胺沉积和 DAB 染色，照射视野应清晰可见。使用钢锯或任何其他合适的仪器从楼板上切出感兴趣的区域。将切口放入超微量离心机简单支架中。

设置超微量切片机以进行最终的块修剪。使用剃须刀片，准备金字塔形的皮球。金字塔顶部平坦区域的大小应约为400×200微米。

将准备好的金字塔安装到超微球臂中并安装刀。准备各节。截面厚度可以调整以适应实验要求。

我们的目标是进行EM断层扫描。因此，我们制备了厚度为250纳米的切片，也称为半薄切片。从刀刃上取下这些部分，然后将其安装在槽栅上。

我们用了一个槽格，它们周围是一毫米的圆形，一毫米的侧面开口。小开口尺寸提供了更好的截面稳定性。让样品在网格上干燥。

此时，各部分已准备好进行观察。将网格放入电子显微镜样品架中。将样品装入电子显微镜。

获取倾斜系列。哺乳动物细胞核中的复制病灶根据S期进展显示出不同的分布模式。通过与荧光标记的叠氮化物的点击反应确认的成功EdU标记在顶部固定戊二醛后在异质细胞群中显示出典型的复制模式。

链霉亲和素标记可受戊二醛影响。所以首先检查荧光链霉亲和素染色在与链霉亲和素纳米金相同的条件下在底部。银增强手术的良好结果是一些细胞核的深棕色染色和非常微弱的黄色细胞体染色，如底部所示。

预嵌入标记的优点是可以选择用于切片的单元格。在这个阶段是可能的，因为标记图案在明场显微镜下变得可见。适当的标记会产生边界清楚的复制站点。

箭头显示DAB染色的染色质纤维。右侧的背景标记仅限于每平方微米几个纳米颗粒。半薄切片可用于断层扫描，不需要添加金纳米颗粒。

所描述的方法用于研究具有启用复制的位点的染色质组织。用于分析染色质的复制后重排，包括染色质分离的高分辨率成像。它还用于大染色体结构域的复制标记以及高阶染色质折叠和异染色质的研究。

这种成像技术作为其他非微观方法生成的数据的参考点也很重要。该方法还可以用于相关的显微研究，包括超分辨率技术。这为研究染色质高阶结构及其在细胞各种生理状态下的动力学开辟了新的视野。