Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae
Chapters
Summary September 30th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.
Transcript
Слюнные железы насекомых, необходимы для передачи многих заболеваний человека. Таким образом, лучшее понимание биологии железы заработной платы должно помочь нам, добавить к существующим стратегиям профилактики заболеваний. Этот метод позволит нам быстро спросить, влияют ли мутации в регуляторах-кандидатах на морфологию слюнных желез личинок комаров и потенциально влияют на передачу малярийных паразитов.
Первые несколько раз, когда вы работаете с личинками комаров, их трудно понять, поскольку они быстро двигаются. Чем больше вы тренируетесь, тем лучше вы становитесь. Начинать с процедуры будет Марисоль Лучетти, научный сотрудник моей лаборатории.
Чтобы начать эксперимент, поместите горшечную тарелку на ступень рассекающего микроскопа и перенесите 10 личинок комара L4 на пластину горшка. Затем поместите каплю раствора для рассечения на тарелку горшка отдельно от личинок. Используют щипцы, чтобы поместить одну личинку L4, в рассеченный раствор капли 25% этанола.
Держа в каждой руке число пять щипцов, схватите личинок щипцами чуть ниже головы, доминирующей рукой, и захватите голову личинки недоминирующей рукой, затем осторожно потяните голову с минимальной постоянной силой, чтобы отделить от остальной части тела, в то время как железы остаются прикрепленными к голове. После выброса части тела туши личинки соберите головку или слюнные железы в один миллилитр PBS в трубку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра и дождитесь, пока слюнные железы опустятся на дно буфера. На следующий день слейте раствор, чтобы закрепить ткани, с одним миллилитром холодного 100%-го ацетона в течение 90 секунд.
После удаления ацетона аккуратно промыть ткани три раза, одним миллилитом PBS. Для иммуноокрашивания добавляют первичное антитело, такое как Rab 11, в соответствующем разведении в 200 микролитрах от общего объема PBS. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки.
Инкубируют первичные антитела в течение ночи при четырех градусах, а затем трижды промывают в одном миллилитре PBS. Затем добавляют вторичное антитело, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, в соответствующем разведении, в 200 микролитрах общего объема. После смешивания содержимого с наконечником пипетки инкубируйте ткани с красителями, такими как Nile red и Hoechst в 200 микролитров PBS, при комнатной температуре в течение 60 минут, с последующей промывкой три раза PBS.
Подготовьте слайд микроскопа, добавив 200 микролитров 100% глицерина с пипеткой и перенеся до 20 окрашенных головок с прикрепленными железами и внутренними структурами на предметный предмет микроскопа с помощью мягкой щетки. Разложите образцы головы, чтобы равномерно распределить их по стеклянной горке. Рассматривая под рассекающим микроскопом, отделите личиночную головку от желез, используя две пары щипцов, осторожно потянув две ткани в противоположных направлениях.
Когда все образцы будут сделаны, аккуратно поместите крышку толщиной 1,5 миллиметра поверх слайда, избегая образования пузырьков воздуха, а затем запечатайте слайд прозрачным лаком для ногтей. Слюнные железы относительно легко рассекаются, начиная с личинок четвертой стадии. Личинки самцов и самок можно различить на поздней личиночной стадии L4 красной полосой вдоль спинной грудной клетки самок.
Морфология антенны также более сложна, у самцов, чем у самок личинок L4, как можно видеть, с белыми стрелками, указывающими на них, женскими усиками на левом изображении и мужскими усиками справа. Слюнные железы, выделенные из личинок ранней стадии L4, окрашенные Hoechst, обнаруживают проксимальные и дистальные доли, разделенные узким сужением. Образовавшийся просвет был исследован в иммуноокрашенной дистальной слюнной железе средней и поздней личинки L4.
Апикальные домены секреторных клеток, окружающие формирующийся просвет, имели интенсивное нильское красное окрашивание, наводящее на мысль о микроворсинках, подобных структурам. Окрашивание Rab 11 наблюдалось близко, к апикальной поверхности. Есть только один шаг со временем, и это 90-секундная инкубация тканей в холодном ацетоне.
Этот протокол был разработан только недавно, но мы ожидаем, что он будет полезен всем, кто работает со слюнной железой комара. Мы полностью рассчитываем использовать его часто.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
