सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी डीएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए

प्रोटोकॉल हमें एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन द्वारा प्रेरित डीएनए के दूसरे पुनर्गठन में परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति देता है। डीएनए संरचना में परिवर्तन प्रतिलेखन विनियमन से संबंधित हो सकता है। यह एक आसान और अत्यधिक संवेदनशील तकनीक है जो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड में संरचनात्मक परिवर्तनों को रिकॉर्ड करने के लिए बहुत कम मात्रा में शुद्ध डीएनए का उपयोग करती है।

यह विधि एटीपी-निर्भर क्रोमैटिन रीमॉडलिंग प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता प्रतिलेखन विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। शुरू करने के लिए, buffers और अन्य प्रतिक्रिया घटकों के काम सांद्रता को ताजा तैयार करें और प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने से पहले उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर रखें, फिर एक NADH युग्मित ऑक्सीकरण परख का उपयोग करके विभिन्न डीएनए अणुओं की उपस्थिति में प्रोटीन की ATPase गतिविधि को मापें। 0.1 millimolar ADAAD, दो millimolar एटीपी, 10 nanomolar डीएनए, और 1X REG बफर को 96-अच्छी तरह से प्लेट में 250 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा में मिलाएं।

इसके बाद, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, फिर माइक्रोप्लेट रीडर के साथ प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एनएडी + की मात्रा को मापें। 340 नैनोमीटर पर absorbance को मापने के लिए, NADH परख पर क्लिक करें और उपकरण में प्लेट धारक पर 96-अच्छी तरह से प्लेट रखें, फिर absorbance रिकॉर्ड करने के लिए पठन प्लेट बटन पर क्लिक करें। उच्च पारदर्शिता क्वार्ट्ज cuvettes में सीडी स्पेक्ट्रा ले लीजिए.

या तो आयताकार या बेलनाकार cuvettes का उपयोग करें। क्यूवेट को साफ करने के लिए, उन्हें कई बार पानी से धोएं, फिर यह जांचने के लिए कि यह साफ है या नहीं, क्यूवेट में पानी या बफर का स्कैन करें। प्रतिक्रियाओं के लिए, पृष्ठ-शुद्ध डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग करें।

तेजी से ठंडा करने के लिए, हीटिंग ब्लॉक पर तीन मिनट के लिए डीएनए को 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें और तुरंत इसे बर्फ पर ठंडा करें। धीमी गति से ठंडा करने के लिए, डीएनए को तीन मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद, इसे प्रति मिनट एक डिग्री सेल्सियस की दर से कमरे के तापमान पर ठंडा करने की अनुमति दें। बेसलाइन स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक-एक करके कुल पांच नियंत्रण प्रतिक्रियाएं सेट करें।

सभी प्रतिक्रियाओं में प्रतिक्रिया की मात्रा को 300 माइक्रोलीटर पर रखें। सीडी स्पेक्ट्रा को रिकॉर्ड करने के लिए, 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक-एक करके कुल पांच प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाएं स्थापित करें। स्कैन रिकॉर्ड करने के लिए, गैस को चालू करें और सीडी स्पेक्ट्रोमीटर को चालू करें।

10 से 15 मिनट के बाद, दीपक को चालू करें, पानी के स्नान को चालू करें और धारक का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। अगला, सीडी स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर खोलें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, तरंग दैर्ध्य सीमा 180 से 300 नैनोमीटर पर, प्रति बिंदु समय 0.5 सेकंड तक, और स्कैन संख्या पांच तक, फिर प्रो डेटा व्यूअर पर क्लिक करें, एक नई फ़ाइल बनाएं, और प्रयोग और तिथि के विवरण के साथ इसका नाम बदलें। अगला, बेसलाइन और प्रयोगात्मक प्रतिक्रियाओं को पिपेटिंग द्वारा मिलाएं और ध्यान से प्रतिक्रिया मिश्रणों को एक-एक करके क्यूवेट में स्थानांतरित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।

यदि एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग कर रहा है, तो आवश्यक समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, फिर स्कैन लें। एटीपी हाइड्रोलिसिस को रोकने के लिए डीएनए, एटीपी, मैग्नीशियम और प्रोटीन युक्त बफर में ईडीटीए जोड़ें। ATPase गतिविधि को पूरी तरह से बाधित करने के लिए, EDTA एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं।

सॉफ़्टवेयर में संबंधित प्रतिक्रियाओं से बेसलाइन को घटाएं और सीडी स्पेक्ट्रम सॉफ़्टवेयर में या डेटा प्लॉटिंग सॉफ़्टवेयर में डेटा को चिकना करें, फिर माध्य अवशेषों के खिलाफ तरंग दैर्ध्य का एक ग्राफ प्लॉट करें और चोटियों का विश्लेषण करें। एम-सिलवटों से पता चला है कि एमवाईसी डीएनए के दोनों स्ट्रैंड एक स्टेम लूप जैसी संरचना बना सकते हैं। आगे की एम-फोल्ड संरचनाएं और जी क्वाड्रप्लेक्स जीईसीई वाले रिवर्स डीएनए अनुक्रम को यहां दिखाया गया है।

एटीपी और एडीएडी की अनुपस्थिति और उपस्थिति में तेजी से ठंडा जीईसीई के सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि एडीएएडी दो सकारात्मक चोटियों को प्रेरित करता है, एक 258 नैनोमीटर पर और दूसरा 210 नैनोमीटर पर। EDTA के अलावा इस संरचनात्मक परिवर्तन निरस्त करता है। सीडी स्पेक्ट्रा में अब एक नकारात्मक 210 नैनोमीटर शिखर और 230 और 250 नैनोमीटर पर चोटियों के साथ एक व्यापक सकारात्मक बैंड है।

QGRS मैपर और एम-फोल्ड विश्लेषण से पता चला है कि DROSHA, DGCR8, और DICER के प्रमोटर क्षेत्रों में G quadruplex और स्टेम जैसी संरचनाओं को बनाने की क्षमता है। DROSHA जोड़ी पांच के सीडी स्पेक्ट्रा से पता चला है कि ADAAD 210 नैनोमीटर पर एक नकारात्मक चोटी और 260 नैनोमीटर पर एक सकारात्मक चोटी को प्रेरित करता है। यह स्पेक्ट्रम ADNA की एक विशेषता है।

DGCR8 जोड़ी एक के सीडी स्पेक्ट्रा ने 210 नैनोमीटर पर एक सकारात्मक चोटी और 260 नैनोमीटर पर एक व्यापक नकारात्मक चोटी दिखाई। यह स्पेक्ट्रम बी से एक्स संक्रमण की विशेषता है। DGCR8 युग्म सात के लिए, 210 और 270 नैनोमीटर पर मजबूत सकारात्मक चोटियों और 250 नैनोमीटर पर एक नकारात्मक चोटी देखी गई थी।

यह स्पेक्ट्रम समानांतर जी चतुर्भुज डीएनए संरचनाओं की विशेषता है। अंत में, DICER जोड़ी के लिए एक, 210 नैनोमीटर और दो नकारात्मक चोटियों पर एक सकारात्मक चोटी, एक 230 नैनोमीटर पर और दूसरा 260 नैनोमीटर पर देखा गया था। ये चोटियां ए से एक्स डीएनए संक्रमण की विशेषता हैं।

सुनिश्चित करें कि डीएनए और प्रोटीन की शुद्धता 99% या उससे अधिक है। क्यूवेट साफ होना चाहिए और बेसलाइन एक मिलेइडग्री से कम होनी चाहिए। सभी अभिकर्मक शुद्ध होने चाहिए ताकि पृष्ठभूमि एक मिलिडेग्री से कम हो।