Neuroscience
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वयस्क Zebrafish में तैरना धीरज और तैरना व्यवहार का आकलन
Chapters
Summary November 12th, 2021
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रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद कार्यात्मक वसूली में सक्षम, वयस्क ज़ेबराफ़िश तंत्रिका उत्थान के जन्मजात तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली है। यहां, हम रीढ़ की हड्डी के उत्थान के कार्यात्मक रीडआउट के रूप में तैरने धीरज और तैरने के व्यवहार का वर्णन करते हैं।
Transcript
ज़ेब्राफ़िश रीढ़ की हड्डी की चोट से उबरने की उनकी क्षमता के कारण एक मूल्यवान तंत्रिका पुनर्जनन मॉडल प्रदान करता है। यह विधि कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के रीडआउट के रूप में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार का वर्णन करती है। यह तकनीक वयस्क ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार का विश्वसनीय और मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान करती है।
ये विधियां न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल विकास, बीमारी और उत्थान के अध्ययन के लिए समान रूप से लागू होती हैं। तैरने धीरज का आकलन करने के लिए, प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रयोग लेबल बॉक्स पर क्लिक करें और Uswim और Uwater uncheck.
फिर पानी की वर्तमान गति को समायोजित करने के लिए नीचे बाईं ओर यूवाटर बॉक्स में प्रवाह की गति बदलें। कोई स्वचालित प्रोटोकॉल प्रारंभ करने के लिए, लॉगिंग प्रारंभ करें बॉक्स पर क्लिक करें. खुलने वाली संवाद विंडो में, ड्रॉपडाउन सूची से स्वचालित चुनें.
पहले सहेजी गई प्रोटोकॉल फ़ाइल को खोलने के लिए, प्रोटोकॉल फ़ाइल के आगे फ़ाइल आइकन पर क्लिक करें. इसके बाद, लॉग फ़ाइल के आगे फ़ाइल चिह्न पर क्लिक करके आउटपुट फ़ाइल सेट करें। फ़ाइल एक्सप्लोरर विंडो में जो खुलता है, आउटपुट फ़ाइल का नाम दें और इसे वांछित स्थान पर सहेजें।
उसके बाद, कंप्यूटर स्क्रीन पर प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर और टाइमर विंडो के लिए एक साथ पहुँच सुनिश्चित करने के लिए एक विभाजित लैप टाइमर विंडो सेट करें। इसके बाद, तैरने वाली सुरंग से उन्हें हटाने के बाद थकी हुई मछली को घर देने के लिए एक मछली संग्रह टैंक स्थापित करें। संग्रह टैंक और zebrafish प्रणाली पानी के साथ एक लंबी polyvinyl क्लोराइड ट्यूब भरें।
संग्रह टैंक में प्रीफिल्ड ट्यूब के एक छोर को रखें और दूसरा बफर टैंक में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पानी बफर टैंक से संग्रह टैंक में स्वतंत्र रूप से प्रवाहित हो सकता है। पानी के प्रवाह को रोकने के लिए एक बाइंडर क्लिप के साथ ट्यूब के ऊपरी छोर को क्लैंप करें, और आवश्यकतानुसार पानी के बहिर्वाह को नियंत्रित करने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करें। तैरने की सुरंग के अंदर मछली के एक समूह को रखने से पहले तैरने धीरज ढक्कन के साथ तैरने वाली सुरंग को बंद करें।
तैरने की सुरंग और प्रवाह दिशा में मछली को अनुकूलित करने के लिए, स्प्लिट लैप टाइमर शुरू करें और पहले पांच मिनट के लिए शून्य सेंटीमीटर प्रति सेकंड, अगले पांच मिनट के लिए नौ सेंटीमीटर प्रति सेकंड, और अगले पांच मिनट के लिए 10 सेंटीमीटर प्रति सेकंड के लिए वर्तमान वेग को समायोजित करें। Acclimation के बाद, प्रोटोकॉल खोलें और स्वचालित प्रवाह वेग नियंत्रण कार्यक्रम शुरू करें, जो हर मिनट दो सेंटीमीटर प्रति सेकंड पानी की वर्तमान गति को बढ़ाएगा। थकावट के लिए मछली की निगरानी करें।
थकी हुई मछली को तैरने वाली सुरंग के पीछे के छोर की ओर धकेल दिया जाएगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक मछली थक गई है, धीरे से सुरंग के पीछे के छोर पर टैप करें या मछली को तैरने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए उस क्षेत्र पर एक छाया बनाएं। थकी हुई मछली ने चौंका देने वाली उत्तेजना का जवाब नहीं दिया और सुरंग के पिछले छोर पर फ्लैट लेट गया।
जब एक मछली समाप्त हो जाती है, तो मछली संग्रह ट्यूब को अनक्लैम्प करें। तैरने सुरंग खिड़की खोलें और संग्रह टैंक में मछली इकट्ठा। स्प्लिट लैप टाइमर का उपयोग करके थकावट पर समय रिकॉर्ड करें।
सभी मछलियों के थक जाने और संग्रह टैंक में एकत्र होने के बाद, प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर पर आपातकालीन स्टॉप बटन पर क्लिक करें और टाइमर को रोकें। तैरने के व्यवहार परख के लिए फिल्मों पर कब्जा करने के लिए, तैरने की सुरंग में मछली का एक समूह रखें और एक मानक, पूरी तरह से संलग्न ढक्कन का उपयोग करके सुरंग को बंद करें। उसके बाद, एक नई रिकॉर्डिंग विंडो खोलें और फ़ाइल का नाम दें।
अभी तक रिकॉर्ड क्लिक न करें. एक नया प्रयोग शुरू करने से पहले, तैरने की सुरंग के किनारे पर एक पेपर तौलिया या कपड़े का टुकड़ा रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी व्यवहार मछली तैराकी के कारण हैं, न कि पर्यावरण में आंदोलन के कारण होने वाली चौंकाने वाली प्रतिक्रिया के कारण। यह सुनिश्चित करने के बाद कि पानी शांत है और फ्रेम में कोई लहर नहीं चल रही है, फिल्म फ़ाइल को रिकॉर्ड करना शुरू करने के लिए कैमरा सॉफ़्टवेयर विंडो में रिकॉर्ड पर क्लिक करें।
फिर प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर में प्रारंभ करें पर क्लिक करें, जो निर्बाध रूप से जारी रहेगा। यह सुनिश्चित करने के लिए फिल्म देखें कि कोई फ्रेम नहीं गिराया गया है, फील्ड-ऑफ-व्यू में कोई बुलबुले नहीं हैं, और सभी मछलियां रिकॉर्ड की गई हैं। एक बार फिल्म रिकॉर्डिंग पूरी हो जाने के बाद, प्रवाह वेग नियंत्रण प्रोटोकॉल को समाप्त करने के लिए आपातकालीन स्टॉप पर क्लिक करें और जांचें कि डेटा आउटपुट फ़ाइल स्वचालित रूप से सहेजी गई है।
उसके बाद, चलचित्र फ़ाइल को सहेजने के लिए रिकॉर्डिंग विंडो बंद करें। रिकॉर्डिंग के बाद, ढक्कन निकालें। सावधानी से मछली को पुनः प्राप्त करें और उन्हें अपने टैंक में वापस कर दें।
कैप्चर की गई फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए, tracking_v2 खोलें। फिजी में ijm स्क्रिप्ट और कार्यक्रम शुरू करने के लिए भागो पर क्लिक करें. पॉपअप विंडो में, खोलें पर ट्रैक करने और क्लिक करने के लिए तैरने के व्यवहार फिल्मों वाले फ़ोल्डर का चयन करें।
पहली फिल्म, एक संवाद बॉक्स, और क्षेत्र-के-ब्याज, या आरओआई प्रबंधक में से एक के फ्रेम की तलाश करें, जो ऊपर आएगा। संवाद बॉक्स में दिए गए निर्देशों का पालन करें और तैरने सुरंग कक्ष के नीचे एक आरओआई बनाएं। फिर ठीक पर क्लिक करें और सुनिश्चित करें कि कोई काला कोनों को देखा जाता है।
थ्रेशोल्ड विंडो एक संपादित थ्रेशोल्ड फ्रेम एक के साथ खुलेगा। काले और सफेद से लाल रंग में रंग योजना बदलें और अधिकतम मूल्य को समायोजित करें जब तक कि फ्रेम एक केवल लाल रंग में मछली को नहीं दिखाता है और कुछ और नहीं। थ्रेशोल्ड रिकॉर्ड करें और संवाद बॉक्स में ठीक क्लिक करें.
संरेखित करने, असेंबल करने और वर्णनात्मक आँकड़ों को प्राप्त करने के लिए, SwimBehavior_v7-3 खोलें. RStudio में आर स्क्रिप्ट और स्क्रिप्ट अनुभाग के ऊपरी दाएं कोने में स्रोत पर क्लिक करें। खुलने वाली किसी नई विंडो में, _raw वाले फ़ोल्डर का चयन करें.
CSV फ़िजी द्वारा जनरेट की गई फ़ाइलें और खोलेंक्लिक करें। प्रोग्राम स्वचालित रूप से चलेगा। पॉपअप संवाद बॉक्स में, प्रत्येक फिल्म में मछली की संख्या की पुष्टि करें।
यदि दी गई संख्याएँ सही हैं या नहीं, तो हाँ पर क्लिक करें यदि संख्याएँ गलत हैं। एक बार जब फ़ाइलें संरेखित हो जाती हैं, तो नए-जनरेट किए गए _aligned के लिए जाँच करें। csv फ़ाइल.
यह सुनिश्चित करने के बाद कि प्रोग्राम डेटा को जोड़ता है, आँकड़े चलाता है, और आउटपुट ग्राफ़ प्लॉट करता है, _raw वाले पैरेंट फ़ोल्डर के भीतर परिणाम लेबल वाले नए फ़ोल्डर में उत्पन्न विश्लेषण फ़ाइलों की जाँच करें. csv और _aligned. csv फ़ाइलें.
चोट के बाद दो, चार और छह सप्ताह में मूल्यांकन किए गए तैराकी धीरज ने दो सप्ताह में तैराकी धीरज क्षमता का 60% नुकसान दिखाया। पुनर्जन्म मछली ने धीरे-धीरे चोट के बाद चार और छह सप्ताह में तैरने की सहनशक्ति हासिल कर ली। तैरने के व्यवहार परख में, नियंत्रण एक ऊंचा वाई स्थिति के अनुरूप तैरने सुरंग कक्ष के सामने के हिस्से में तेजी से तैरा।
इसके विपरीत, चोट के बाद दो सप्ताह में, घायल मछली वर्तमान के खिलाफ स्थिर तैरने की क्षमता बनाए नहीं रख सकी। नतीजतन, उनके तैरने वाले ट्रैक अधिक अनियमित हैं, वाई स्थिति में समग्र कमी के साथ। चोट के बाद चार और छह सप्ताह में वाई की स्थिति बढ़ गई, यह दर्शाता है कि पुनर्जीवित जानवरों ने धीरे-धीरे तैरने की अपनी क्षमता हासिल कर ली।
इसके अलावा, घायल नियंत्रणों के सापेक्ष, चोट के बाद दो सप्ताह में घायल जानवर स्पष्ट रूप से कम सक्रिय थे, तैरने वाली सुरंग के पीछे के चतुर्थांश में रुक गए थे, और कम-वर्तमान वेगों के खिलाफ तैरने की अपनी क्षमता खो दी थी। कार्यात्मक वसूली प्राप्त करने के लिए उनकी जन्मजात क्षमता के अनुरूप, घाव वाले जानवरों ने धीरे-धीरे चोट के बाद चार और छह सप्ताह में तैरने के व्यवहार मापदंडों को सामान्य ीकृत किया। इस प्रोटोकॉल में प्रवाह वेग नियंत्रण सॉफ़्टवेयर का उपयोग वैकल्पिक है।
विकल्प मैन्युअल रूप से पानी के वर्तमान मोटर को नियंत्रित करना है। इस अध्ययन में वर्णित assays का उपयोग तंत्रिका, मांसपेशियों, या कंकाल फेनोटाइप के लिए पूर्व-स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। ब्याज के ऊतक को तब हिस्टोलॉजिकल या आणविक परीक्षा के लिए काटा जा सकता है।
हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों ने जीन की पहचान करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है जो जन्मजात तंत्रिका मरम्मत के लिए आवश्यक हैं और कारक जो तंत्रिका उत्थान को बढ़ाने के लिए पर्याप्त हैं।
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