Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Høy gjennomstrømningsanalyse av ikke-fotokjemisk slukking i avlinger ved bruk av pulsamplitudemodulert klorofyllfluorometri
Chapters
Summary July 6th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollen introduserer en høy gjennomstrømningsmetode for måling av avslapning av ikke-fotokjemisk slukking ved pulsamplitudemodulert klorofyllfluorometri. Metoden brukes på feltdyrket Glycine max og kan tilpasses andre arter for å screene for genetisk mangfold eller avlspopulasjoner.
Transcript
Denne metoden kan gi et innblikk i den genetiske variasjonen i ikke-fotokjemisk slukking som er tilgjengelig i genetiske mangfoldspaneler eller avlspopulasjoner. Den største fordelen med denne teknikken er potensialet til å skjerme et stort antall genotyper for variasjon i ikke-fotokjemisk slukking innen en enkelt dag. Protokollen presenteres for glycin max eller soyabønne, men kan tilpasses for å analysere andre planterom hvorfra løfteskiver kan samles inn.
For noen som utfører protokollen for første gang, er nøkkelen å håndtere løfteskiven for å forhindre skade eller overmette svamper med vann. For å begynne, prøv plantene på feltstedet 30 dager etter spiring. Fyll 1/3-nivå destillert vann i alle brønnene på en 24-brønns plate.
Merk lokket og siden av platen med replikasjonene som skal prøves. Hold det yngste fullutvidede bladet som er tilstede på toppen av planten mot en gummipropp. Trykk en nummer to Humboldt korkborer gjennom bladet og vri for å kutte en plate, unngå midtribben.
Samle deretter fem plater fra samme blad for tekniske replikasjoner. Skyv bladskivene ut av korkboreren i en enkelt brønn på en 24-brønns plate ved hjelp av en bomullspinne og gjenta dette for en annen plante av samme genotype. Kontroller at alle bladskivene flyter i vannet.
Hvis ikke, flytt bladskivene forsiktig til siden av en brønn i flytende stilling med en bomullspinne. Gå videre til prøvetakingsplater fra følgende plott. Plasser lokket og forsegl med en halvtransparent fleksibel film.
etter å ha fullført prøvetakingen i hele platen med 24 brønner. Oppbevar tallerkenen uten direkte sollys i en pose, eske eller tom kjøler. I et rent laboratorierom, trykk på lokket på den forseglede platen for å løsne bladskiver som sitter fast på lokket under transport.
Pakk ut filmen og fjern lokket. Overfør en bladskive fra den første posisjonen til 24-brønnsplaten til en ny 96-brønns plate med bladskiven vendt flatt ned i bunnen av brønnen. Skjær et nasalt aspiratorfilter i to.
Dypp det resulterende filteret halvveis i vann og klapp på et papirhåndkle for å fjerne overflødig væske. Sett filteret inn i brønnen med bladskiven for å opprettholde fuktigheten. Ta en annen bladskive fra den første posisjonen til 24-brønnsplaten og plasser den med forsiden ned i neste tilgjengelige posisjon på 96-brønnplaten.
Dypp den resterende halvdelen av nesefilteret produsert i vann og klapp det på et papirhåndkle før du setter det inn i brønnen med den andre bladskiven. Tape øverste høyre hjørne for å orientere platen i mørket for avbildning. Tetningsplater med en halvtransparent fleksibel film og pakk platen i aluminiumsfolie.
Skriv plott-ID-ene og plate-ID-en på aluminiumsfolien. Plasser plater i en mørk boks eller et skap i minst 30 minutter for avslapning av de to første fasene av ikke-fotokjemisk slukking. Bruk en langvarig mørk inkubasjonsperiode på en time før avbildning hvis langsiktige faser av ikke-fotokjemisk slukking er av interesse.
Forbered en ekstra dummyplate for fokusering under analyse ved å plassere en bladskive i hvert hjørne av en fersk 96-brønns plate og en i midten. Sikre bladskiver med nesefiltre som gjort med tidligere plater, forsegl platen og rug i mørket ved romtemperatur og 50% relativ fuktighet. Slå på bildebehandleren og åpne bildebehandlingsprogramvaren.
Klikk på Innstillinger etterfulgt av Protokoll for å åpne et vindu for oppføring av trinn i PAM eksperimentell protokoll. Angi de tekniske spesifikasjonene til maskinen som er oppgitt i manuskriptet. Sett programmet til å starte med en mettende puls for å måle maksimal kvanteeffektivitet av mørktilpasset fotosyntese ved å skrive inn 20 sekunder i boksen som heter Etter en forsinkelse på.
Klikk på boksen Bruk puls og skriv inn 1 i boksen med tittelen Dette antall ganger. Sett puls PPFD til 6,152, pulslengden til 800 millisekunder, og merk av i boksen Ta F prime og FM prime bilder med alle pulser. Merk av for Sett inn etter for å legge til et andre trinn i protokollen.
Skriv inn 30 sekunder i boksen med tittelen Etter en forsinkelse på. Velg deretter alternativet Endre aktinisk og skriv inn 50 i boksen med tittelen Actinic PPFD for å sette lysintensiteten til kammeret til 50 PPFD. Klikk Sett inn etter for å legge til et nytt trinn i protokollen, og skriv inn 150 sekunder i boksen Etter en forsinkelse på.
Velg Bruk puls og skriv inn 4 i boksen Dette antall ganger for å bruke målepulser hvert 150. sekund fire ganger på rad mens aktinisk lys holdes på 50 PPFD. Juster forsinkelsen og lysintensiteten for hvert trinn i henhold til verdiene i manuskriptet før du lagrer protokollen som en PCL-fil på ønsket sted. Slå av lyset og plasser dummyplaten med forsiden ned på prøvetrinnet slik at bladets adaxiale overflate peker opp mot detektoren og at svampen vender ned mot plattformen.
Still prøvetrinnhøyden slik at bladskivene er 140 millimeter over bunnen av instrumentet. Klikk på ikonet koble til / koble til bildekamera og maskinvarekamera for å starte kameraet. Klikk på fokusfluorescenssymbolet, representert av et rødfarget, tosidig pilikon med to grønne linjer ved foten, og juster linsen og eksponeringen for å bringe platen i fokus.
Klikk på fokusfluorescensikonet igjen for å slå av det blinkende lyset. Arbeid i mørket, bytt ut dummyplaten med platen som skal analyseres. Plasser den med forsiden ned med båndet på utsiden som brukes til å orientere øverste høyre hjørne og klikk på kartbildekameraikonet.
Juster bildeeksponeringen ved å åpne eller lukke blenderåpningen til linjen i popup-vinduet er plassert i den grønne sonen. Klikk på Prøv igjen-knappen etter hver justering av blenderåpningen til eksponeringen er riktig justert og instrumentet tar et bilde. Høyreklikk på bildet og velg Bruk bildeisolasjon for å blokkere bakgrunnssignaler.
Det fokuserte bladområdet vises i grått og bakgrunnen i blått. Velg området eller pikslene av interesse for å inkludere bare bladskivene ved å justere histogrammet og gammanivået fra nedtrekksmenyen Endre bilde ved å høyreklikke på bildet. Høyreklikk på bildet og velg Slett høye og lave kutt for å slette de lyseblå uthevede områdene.
Høyreklikk på bildet og velg Slett strays for å fjerne piksler som ikke berører de tre siste andre pikslene. Eventuelle områder på bildet som vises som isolerte øyer, analyseres separat og inkluderes i den endelige datautgangen. Klikk på kjør protokollikonet for å starte programmet.
En tidtaker vises nederst på skjermen som informerer deg om hvor lenge protokollen har igjen å kjøre. Vent til protokollen er ferdig. Klikk fil og lagre som for å lagre dataene som en igr-fil.
Lukk vinduet ved å klikke på det røde krysset øverst til høyre i vinduet før du starter en ny prøveplate. For å eksportere klorofyllfluorescensdata, åpne igr-filen i bildebehandlingsprogramvaren og klikk på Fil etterfulgt av Eksporter til mappe for å opprette en ny mappe med alle nødvendige filer. En typisk måling av ikke-fotokjemisk slukking i feltdyrkede soyabønner viste at etter en innledende metningsblits for å bestemme Fv / Fm når bladskivene ble utsatt for lite lys på 50 mikromol per meter per sekund, var den ikke-fotokjemiske slukkingen mindre enn en.
Videre, ved overføring til høyt lys på 2.000 mikromol per meter per sekund, økte ikke-fotokjemisk slukking opp til maksimumsverdien på fire etter 15 minutter. En mislykket måling viste en minimal økning i ikke-fotokjemisk slukking ved overføring til høyt lys. Orientering av plater i bildeapparatet og en klart definert plan for prøvetaking og plating av bladskiver er avgjørende for å sikre at dataene er koblet til riktig genotype.
Denne protokollen kan kvantifisere virkningen av miljøvariabler som tørke og shedding på ikke-fotokjemisk slukking eller evaluere ikke-fotokjemisk slukking på forskjellige baldakinnivåer for å avgrense avlingsmodeller.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
