Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analys med hög genomströmning av icke-fotokemisk släckning i grödor med hjälp av pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollet introducerar en högkapacitetsmetod för att mäta avslappningen av icke-fotokemisk släckning genom pulsamplitudmodulerad klorofyllfluorometri. Metoden tillämpas på fältodlad Glycine max och kan anpassas till andra arter för att screena för genetisk mångfald eller avelspopulationer.
Transcript
Denna metod kan ge en inblick i den genetiska variationen i icke-fotokemisk släckning som finns inom genetiska mångfaldspaneler eller avelspopulationer. Den största fördelen med denna teknik är potentialen att screena ett stort antal genotyper för variation i icke-fotokemisk släckning inom en enda dag. Protokollet presenteras för glycin max eller sojabönor, men kan anpassas för att analysera andra växtutrymmen från vilka lyftskivor kan samlas in.
För någon som utför protokollet för första gången är nyckeln att hantera lyftskivan för att förhindra skador eller övermättnadssvampar med vatten. För att börja, prova växterna på fältplatsen 30 dagar efter spiring. Fyll 1/3-nivå destillerat vatten i alla brunnar på en 24-brunnsplatta.
Märk locket och sidan av plattan med de replikat som ska provtas. Håll det yngsta fullexpanderade bladet som finns på toppen av växten mot ett gummipropp. Tryck en Humboldt-korkborrare nummer två genom bladet och vrid för att klippa en skiva och undvik mittribben.
Samla in fem skivor i följd från samma blad för tekniska replikat. Skjut ut bladskivorna ur korkborren i en enda brunn på en 24-brunnsplatta med en bomullspinne och upprepa detta för en annan växt av samma genotyp. Kontrollera att alla bladskivor flyter i vattnet.
Om inte, flytta försiktigt bladskivor som klibbar på sidan av en brunn till ett flytande läge med en bomullspinne. Gå vidare till provtagningsskivor från följande diagram. Placera locket och försegla med en halvtransparent flexibel film.
efter avslutad provtagning i hela 24-brunnsplattan. Förvara plattan i direkt solljus i en påse, låda eller tom kylare. I ett rent laboratorieutrymme trycker du på locket på den förseglade plattan för att lossa bladskivor som sitter fast på locket under transporten.
Packa upp filmen och ta bort locket. Överför en bladskiva från det första läget på 24-brunnsplattan till en ny 96-brunnsplatta med bladskivan vänd platt ner i botten av brunnen. Skär ett nasalt aspiratorfilter i hälften.
Doppa det resulterande filtret halvvägs i vatten och badda på en pappershandduk för att ta bort överflödig vätska. Sätt in filtret i brunnen med bladskivan för att bibehålla fuktigheten. Ta en andra bladskiva från det första läget på 24-brunnsplattan och placera den med framsidan nedåt i nästa tillgängliga position på 96-brunnsplattan.
Doppa den återstående halvan av näsfiltret som produceras i vatten och badda det på en pappershandduk innan du sätter in det i brunnen med den andra bladskivan. Tejpa det övre högra hörnet för att hjälpa till att orientera plattan i mörkret för avbildning. Försegla plattor med en halvtransparent flexibel film och linda in plattan i aluminiumfolie.
Skriv plot-ID och platt-ID på aluminiumfolien. Placera plattorna i en mörk låda eller skåp i minst 30 minuter för avkoppling av de två första faserna av icke-fotokemisk släckning. Använd en långvarig mörk inkubationsperiod på en timme före avbildning om långsiktiga faser av icke-fotokemisk släckning är av intresse.
Förbered en extra provplatta för fokusering under analysen genom att placera en bladskiva i varje hörn av en ny 96-brunnsplatta och en i mitten. Säkra bladskivor med näsfilter som gjort med tidigare plattor, täta plattan och inkubera i mörkret vid rumstemperatur och 50% relativ luftfuktighet. Slå på avbildaren och öppna bildprogramvaran.
Klicka på Inställningar följt av Protokoll för att öppna ett fönster för inmatning av steg i PAM-experimentprotokollet. Ställ in de tekniska specifikationerna för maskinen som finns i manuskriptet. Ställ in programmet så att det börjar med en mättande puls för att mäta den maximala kvanteffektiviteten för mörkanpassad fotosyntes genom att ange 20 sekunder i rutan med namnet Efter en fördröjning av.
Klicka på rutan Använd puls och ange 1 i rutan med titeln Detta antal gånger. Ställ in pulsen PPFD på 6, 152, pulslängden på 800 millisekunder och markera rutan Ta F prime- och FM-primtalsbilder med alla pulser. Markera Infoga efter för att lägga till ett andra steg i protokollet.
Ange 30 sekunder i rutan med titeln Efter en fördröjning av. Välj sedan alternativet Ändra aktinisk och ange 50 i rutan med titeln Actinic PPFD för att ställa in ljusintensiteten till kammaren till 50 PPFD. Klicka på Infoga efter för att lägga till ett nytt steg i protokollet och ange 150 sekunder i rutan med titeln Efter en fördröjning av.
Välj Använd puls och ange 4 i rutan med titeln Detta antal gånger för att applicera mätpulser var 150: e sekund fyra gånger i rad medan det aktiniska ljuset hålls vid 50 PPFD. Justera fördröjningen och ljusintensiteten för varje steg enligt värdena i manuskriptet innan du sparar protokollet som en pcl-fil på önskad plats. Släck ljuset och placera provdockans platta med framsidan nedåt på provsteget så att bladets adaxiala yta pekar uppåt mot detektorn och att svampen är vänd nedåt mot plattformen.
Ställ in provstegets höjd så att bladskivorna ligger 140 millimeter över instrumentets bas. Klicka på ikonen anslut/koppla från till bildkamera och hårdvarukamera för att starta kameran. Klicka på fokusfluorescenssymbolen, representerad av en rödfärgad, dubbelsidig pilikon med två gröna linjer vid basen, och justera linsen och exponeringen för att få plattan i fokus.
Klicka på fokusfluorescensikonen igen för att stänga av den blinkande lampan. Arbeta i mörkret, byt ut provplattan med plattan som ska analyseras. Placera den med framsidan nedåt med tejpen på utsidan som används för att orientera det övre högra hörnet och klicka på kartbildskameraikonen.
Justera bildexponeringen genom att öppna eller stänga bländaren tills fältet i popup-fönstret är placerat i den gröna zonen. Klicka på knappen Försök igen efter varje justering av bländaren tills exponeringen är korrekt justerad och instrumentet tar en bild. Högerklicka på bilden och välj Använd bildisolering för att blockera bakgrundssignaler.
Det fokuserade bladområdet visas i grått och bakgrunden i blått. Välj det eller de pixlar som är av intresse om du bara vill inkludera bladskivorna genom att justera histogrammet och gammanivån från rullgardinsmenyn Ändra bild genom att högerklicka på bilden. Högerklicka på bilden och välj Ta bort höga och låga snitt för att ta bort de ljusblå markerade områdena.
Högerklicka på bilden och välj Ta bort strö för att ta bort pixlar som inte rör de tre sista andra pixlarna. Alla områden på bilden som visas som isolerade öar analyseras separat och inkluderas i den slutliga datautmatningen. Klicka på ikonen kör protokoll för att starta programmet.
En timer visas längst ner på skärmen som informerar dig om hur länge protokollet har kvar att köra. Vänta tills protokollet är klart. Klick Fil och spara som för att spara data som en igr-fil.
Stäng fönstret genom att klicka på det röda korset längst upp till höger i fönstret innan du startar en annan provplatta. För att exportera klorofyllfluorescensdata, öppna igr-filen i bildprogramvaran och klicka på Arkiv följt av Exportera till mapp för att skapa en ny mapp med alla nödvändiga filer. En typisk mätning av icke-fotokemisk släckning i fältodlade sojabönor visade att efter en första mättande blixt för att bestämma Fv / Fm när bladskivorna utsattes för svagt ljus på 50 mikromol per meter per sekund, var den icke-fotokemiska släckningen mindre än en.
Vidare, vid överföring till högt ljus på 2 000 mikromol per meter per sekund, ökade icke-fotokemisk släckning upp till det maximala värdet på fyra efter 15 minuter. En misslyckad mätning visade en minimal ökning av icke-fotokemisk släckning vid överföring till högt ljus. Orienteringsplattor i avbildaren och en tydligt definierad plan för provtagning och plätering av bladskivor är avgörande för att säkerställa att data är kopplade till rätt genotyp.
Detta protokoll kan kvantifiera effekterna av miljövariabler som torka och utsläpp på icke-fotokemisk släckning eller utvärdera icke-fotokemisk släckning vid olika baldakinnivåer för att förfina grödmodeller.
Tags
Biologi nummer 185Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
