Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Hallo, mein Name ist Linda und ich arbeite im Labor von Dr. Edwin Niki an der University of California Irvine. Heute zeige ich Ihnen, wie ich das Cybergrün des Stigmas nutze, indem ich ein Gewebe-PCR-Kit extrahiere, um Mäuse schnell zu genotypisieren oder zu transgen. Normalerweise verwende ich dieses Kit, um unsere embryonalen Mäuse zu genotypisieren, wenn ich akut dissoziative Zellkulturen mache und den Genotyp unserer Maus schnell und schnell herausfinden muss.

Aber für die heutigen Zwecke haben wir ausgewachsene Mäuseschwänze, in denen wir Ihnen zeigen können, wie ich dieses Kit verwende. Dieses Protokoll umfasst einen schnellen Ale-Verdau und eine DNA-Extraktion sowie einen schnellen Neutralisationsschritt. Und wir verwenden die Extrakt-DNA in einer Echtzeit-PCR, in der wir unsere PCR-Amplikons überwachen können.

Wenn Sie also bereit sind, fangen wir an. Bevor wir also loslegen, wollen wir sicherstellen, dass unser Wärmeblock auf 95 Grad Celsius eingestellt ist, dass unser Cybergrün aufgetaut und auf Eis gehalten wird, bis es benötigt wird, und dass unsere anderen Reagenzien auf Raumtemperatur auftauen. In meinem Eiskübel habe ich meine beiden Primer, die wir zur Genotypisierung verwenden werden, und sie wurden speziell für unser interessierendes Gen entwickelt und für QPCR validiert.

Ich habe auch meine Positivkontrolle für das Gen von Interesse und meine Negativkontrolle und eine Gewebeprobe, die ich bereits von einer erwachsenen Maus gesammelt habe. Wenn Sie jetzt Ihre Gewebeprobe entnehmen, ist es sehr wichtig, extrem streng zu sein. Wenn wir embryonale Mausschwänze sammeln, spülen wir unsere Pinzette immer vor und vor jeder Gewebeentnahme mit 70% Ethanol aus.

Und wir spülen die Schwanzproben immer in TBS, zuerst muss man einen Mastermix aus der Gewebevorbereitung und der DNA-Extraktion für jeden Schwanz machen, man braucht 100 Mikroliter der Extraktionslösung und 25 Mikroliter der Gewebevorbereitungslösung. Ich werde mit meinem P 200 und den Filterpipettenspitzen hundert Mikroliter der Extraktionslösungen und 25 Mikroliter der Gewebevorbereitungslösung in ein neues eend rph-Röhrchen abmessen. Sie sollten Ihre Mastermix-Lösung mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.

Und so sollten Sie 125 Mikroliter Ihres Mastermixes in Ihren gewünschten Mastermix geben, wobei Sie darauf achten sollten, dass, wenn es sich um einen erwachsenen Mausschwanz handelt, das abgeschnittene Ende vollständig in die Master-Mikrofonlösung eingetaucht ist und Sie es mit den Fingern vortexen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren können. Während der 10-minütigen Inkubation werde ich meinen Lieblings-grünen Mastermix zubereiten, der den Apfelweingrün-Mastermix enthält, den sie im Kit Milli Q oder Wasser in PCR-Qualität enthalten, sowie unsere Primer, etwas Wasser in PCR-Qualität und unsere Vorwärts- und Rückwärtsprimer. Und das ist es.

Jetzt, da die 10-minütige Inkubation vorbei ist, müssen wir die Reaktion drei Minuten lang bei 95 Grad erhitzen und aktivieren. Unsere dreiminütige Inaktivierung ist abgelaufen und jetzt fügen wir die Neutralisationslösung hinzu, die im Kit enthalten ist, und wir fügen hundert Mikroliter pro Reaktion hinzu und Sie werden dies durch Vortexen mischen. Nachdem Sie den Neutralisationspuffer hinzugefügt haben, können Ihre DNA-Proben bei vier Grad Celsius gelagert werden, bis Sie sie verwenden können.

Wir wollen unseren Genotyp eigentlich sofort. Also gehen wir sofort in die QPCR, damit meine Schwänze neutralisiert werden und bereit sind. Mein cyber green PCR Mastermix ist fertig und ich habe meine PCR-Röhrchen auf einem kalten Block aufgestellt.

Alles, was ich jetzt tun werde, ist, 16 Mikroliter meines Mastermixes in jede Vertiefung zu geben und dann jeweils vier Mikroliter des vergemeinschafteten Extrakts oder vier Mikroliter der Positiv- oder Negativkontrolle hinzuzufügen. Nun, alles, was ich tue, ist, 16 Mikroliter eines Mastermixes zu jedem der Vermögen hinzuzufügen. Dann gebe ich vier Mikroliter des neutralisierten Extrakts zu den 60 Mikrolitern des Mastermixes in der Vertiefung, was insgesamt ein Reaktionsvolumen von 20 Mikrolitern ergibt.

Und ich werde das Gleiche für die Positiv- und Negativkontrolle tun. Zugabe von vier Mikrolitern bis 16 Mikrolitern mit einem PPR-Mastermix. Sobald sie alle hinzugefügt sind, können Sie sie mit einem optisch klaren Acht-Kappen-Streifen verschließen.

Achten Sie darauf, den optisch klaren Teil der Kappen, der sich über Ihren Proben befindet, nicht zu berühren. Also drücke ich mit einem Kim-Tuch auf die Kappen, um sicherzustellen, dass sie versiegelt sind. Also habe ich unseren PCR- und DNA-Mix vorsichtig vortexen und sie nach unten geschleudert, und jetzt sind wir bereit, sie in das QPCR-Gerät zu geben.

Was wir tun werden, ist, dass wir zuerst unsere Proben in die Opticon PCR-Maschine laden und ich werde eine neue Platte einrichten, die unsere erste Vertiefung als Probe sein wird. Unsere zweite Vertiefung wird unsere Positivkontrolle sein, und unsere dritte Vertiefung ist unsere Negativkontrolle, stellen Sie fest, dass unser Reaktionsvolumen insgesamt 20 Mikroliter beträgt. Als nächstes lade ich ein Protokoll, das für die Person entwickelt wurde, war die schnelle Genotypisierung.

Dieses Protokoll umfasst einen dreiminütigen Denaturierungsschritt, einen Zyklus von 15 Sekunden Denaturierung, 15 Sekunden primärem Knien und dann 20 Sekunden primärer Streckung. Jetzt kann der primäre Erweiterungstank tatsächlich auf etwa 10 Sekunden herunterfallen, und dies hat insgesamt nur 40 Sekunden. Für jeden Zyklus haben wir diese drei Schritte, die etwa 40 Mal wie bei einer normalen PCR durchlaufen werden, und am Ende nehmen wir eine Schmelzkurve.

Wir haben also unsere Platte eingerichtet und unser Protokoll geladen. Alles, was wir jetzt tun müssen, ist, unsere QPCR laufen zu lassen, und sie beginnt mit dem dreiminütigen Denaturierungszeug. Aus meiner Erfahrung, wenn ich die Primer verwende, die ich verwende, und die Schwanzproben verwende und Sie nach den Genen suchen, nach denen ich suche, weiß ich, dass meine positiven Ergebnisse bei etwa 25 Zyklen auftreten werden, die eine signifikante Zyklusschwelle überschreiten.

Wann sich das kreuzt, hängt stark von Ihrer Gewebeprobe ab und davon, wonach Sie suchen und wie viel von der DNA ursprünglich vorhanden ist. Wir können also schon sehen, dass unsere Positivkontrolle bereits aufgetaucht ist und es sieht so aus, als ob unsere Stichprobe auch positiv ist. Wie Sie sehen, beginnt es nach unserer positiven Kontrolle ein wenig aufzukommen.

Wir werden es noch abwarten müssen, weil es erst bei 27 Zyklen ist, aber hoffentlich können wir in ein paar weiteren Zyklen sicher sein, dass unsere Probe positiv ist, und ich kann dann mit meinem Experiment fortfahren. An diesem Punkt können Sie sehen, dass die negative Kontrolle gerade erst anfängt, aufzutauchen, und das liegt daran, dass ich einen Überschuss an Schwanz genommen habe. Das hilft Ihnen, sicher zu sein, dass alles, was vor diesem übermäßigen negativen Schwanz auftaucht, positiv sein wird.

An diesem Punkt würde ich also alles, was vor dem Negativen auftaucht, als positiv betrachten und mit meinem Experiment fortfahren. Nachdem der PCR-Zyklus abgeschlossen ist, führt das Gerät eine Schmelzkurvenanalyse durch. Dies wird Ihnen helfen, die Zusammensetzung und Reinheit Ihres Produkts zu bestimmen.

Daran können Sie erkennen, ob Sie die Positiv- und Negativproben richtig ausgewählt haben. Zum Beispiel hat die positive Probe einen spezifischen Peak der scharfen Schmelztemperatur, der einem bestimmten PCR-Produkt entspricht, das amplifiziert wird. Alle negativen Proben weisen einen unspezifischen breiten Schmelztemperatur-Peak auf, der der unspezifischen DNA entspricht, die während der PCR amplifiziert wurde.

Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie wir den Cyber Green Extraktionsverstärker von Sigma verwenden, um erwachsene Mäuseschwänze schnell zu genotypisieren. Aber dieses Kit kann mit verschiedenen tierischen Geweben, Haaren und Speichel verwendet werden, und ich verwende es, um embryonale Schwänze von Mäusen zu genotypisieren. Wir verwenden dieses Kit gerne, weil es schnell ist.

Ich kann meinen Genotyp in einer Stunde zurückbekommen, und es ist sehr bequem und einfach. Also danke fürs Zuschauen und viel Glück.