ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

פרוטוקול זה הוא משמעותי, כי זה מאפשר לך לעשות אימונוהיסטוכימיה על הנוטום של גולם Drosophila, גם לאחר שהם נפצעו בעבר, ותמונה חיה, מבלי לשבש את הארכיטקטורה של הרקמה. טכניקה זו מאפשרת לך לנצל, את המגוון הרחב של כתמי נוגדנים שכבר זמינים, כדי להכתים תאים, מבנים וחלבונים, באפיתל נוטום. השתמשנו בטכניקה זו לאימונוכימיה, ולהכתמת דנ”א.

עם זאת, דיסקציה זו יכולה לשמש כנקודת מוצא לטכניקות אחרות, כגון הכלאה באתרה. פרוטוקול זה יכול להיות קשה, כי הגלמים הם קטנים ועדינים, ולכן זה דורש יד יציבה כדי לבצע את הניתוח. וזה נהיה קל יותר עם הניסיון, אז תרגלו על גלמים לא חשובים לפני החשובים.

התחילו בהסרה קפדנית של שלושה עד ארבעה גלמים בשלב P5, באמצעות היקף דיסקציה, ואספו אותם על שקופית המיקרוסקופ שליד הקלטת. לאחר מכן, מניחים את הגלמים במרחק של לפחות גולם אחד זה מזה, על הקלטת, כשצדי הגחון שלהם למטה. כעת, הניחו טיפה של דבק דבק על סרט פאראפין, או במכסה צינור צנטריפוגה.

לאחר מכן, טבלו את הקצה של קצה פיפטה של 0.1 עד 10 מיקרוליטר בטיפת דבק דבק, והקש על קצה הפיפטה פעמיים על החלקת כיסוי, במרחק של סנטימטר אחד על סנטימטר אחד מהפינה, תוך יצירת קו של דבק דבק, כמחצית מאורך הגלם. לאחר מכן, הגדירו מראש פיפטה P2 בשני מיקרוליטרים, ופיפטה P200 בנפח של 200 מיקרוליטרים, והתאימו להם טיפים. כעת, הכנס מלקחיים ליד צד הראש, והסר בעדינות כמה שיותר ממקרה האישון, עובד מהחלק הקדמי לאחורי.

לאחר מכן, תפסו את הרגליים המתפתחות של הגלם, עם זוג מלקחיים קהים, ומשכו בזהירות את הגלם מהתיק שלו. הניחו את הגלם בפינת החלקה של הכיסוי. תפסו את הגלמים בבטן האחורית, או בכנף המתפתחת, עם מלקחיים קהים.

הרימו והניחו את הצד הגחוני של הגלם כלפי מטה, לתוך קו הדבק. מלאו במהירות את הפיפטה P2, עם שני מיקרוליטרים של PBS חד-חוזק, המכילים 0.1 סידן מילימולרי, ומחזיקים אותו באוויר, מוציאים מספיק כדי ליצור בועה קטנה בקצה. לגעת בבועה הקטנה של התמיסה, לצד אחד של הגלמים בבסיס בית החזה, ואז לחזור על ההליך בצד השני.

לאחר מכן, מלאו את הפיפטה P200, ב-200 מיקרוליטרים של PBS חד-חוזקי, בסידן של 0.1 מילימולר, ואז הניחו את קצה הפיפטה על בית החזה, והוציאו את התכולה כדי להטביע את הגלמים לחלוטין, ושארית הדבק הדביק יתמצקה מיד. כעת, הסר כ -100 מיקרוליטרים של תמיסת PBS, כך שהגלמים בקושי שקועים, לפני שתמשיכו מיד לשלב הבא. כדי לנתח את הנוטום, תפסו זוג מספריים של מיקרו דיסקציה, תוך שהם מצמידים צד אחד של הידית לאצבע המורה והאצבע האמצעית של היד הדומיננטית, כך שהאגודל של היד הדומיננטית מפעיל את כוח החיתוך.

לאחר מכן, ייצבו את צוואר המספריים כנגד האצבע האמצעית של היד הלא דומיננטית, תוך כדי החלקת הכיסוי, עם אצבע הטבעת של היד הלא דומיננטית. כעת, צלפו באמצע הבטן הגבית כדי ליצור חור קטן של כ-0.2 עד 0.5 מילימטר. כדי לבודד את הרקמה הגבית, לעשות חתכים קטנים 0.5 עד 0.75 מילימטר דרך הכסות, מן האחורי הקדמי, ובסופו של דבר, אלה יקיפו את הרקמה הגבית.

יתר על כן, יש לחזור על חתכים אחוריים קדמיים בצד השני של הגלמים. סובבו את שלב הנתיחה, כדי לאפשר חתך נקי בראש במידת הצורך. קבעו אם ה-notum בודד, על-ידי כך שתראו אם הוא מועבר בקלות.

הוסיפו כ-200 מיקרוליטרים של PBS חד-חוזקי למרכז החלקת הכיסוי, וצרו תעלה המחברת אותה לטיפת הנתיחה המקורית, על ידי גרירה עדינה של קצה הפיפטה על פני זכוכית הכיסוי, מהטיפה החדשה לזו המקורית. באמצעות זוג מלקחיים קהים, דוחפים או גוררים בעדינות את הנוטום המבודד למרכז החלקת הכיסוי ומסובבים, כך שהצד הפנימי פונה כלפי מעלה. החזיקו את הנוטום למטה עם מלקחיים קהים, על ידי לחיצה לתוך החלק הבטן או הראש.

באמצעות זוג מלקחיים חדים וגירושים עדינים של PBS חד-חוזק, מתוך פיפטה של 200 מיקרוליטר, הסר את כל שאריות הגוף השמן, רצועות השרירים או הרמת המו, כדי לחשוף את אפיתל החד-שכבתי במלואו. לאחר שהרקמה נקייה, השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר כמה שיותר מתמיסת ה- PBS, תוך ניטור עם היקף הנתיחה, כדי להימנע משאיפת הנוטום. לאחר הסרה מקסימלית של נוזלים, יש להשתמש ברקמה סופגת, כדי לנגב בזהירות את שארית הדבק, פגר האישונים ושאר הפסולת על החלקת הכיסוי.

כעת, הוסיפו 150 עד 200 מיקרוליטרים של 4% PFA, ותיקנו למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ובהתאם למהירות הנתיחה, ניתן לנתח גלם אחד עד שלושה נוספים, במהלך הקיבעון של הגלם הראשון על החלקות כיסוי נפרדות. הסר את ה- PFA, והחלף אותו ב- PBS בעל חוזק יחיד, כדי לשטוף את ה- notum פעם אחת למשך 30 שניות.

אם ממשיכים עם צביעת נוגדנים, בצע שלוש שטיפות של חמש דקות, ב- PBS או PBST חד-חוזק, כדי לחלחל לרקמה אם האנטיגן הוא תוך תאי. ניתן לאחסן את הדגימה ב- PBS בעל חוזק יחיד, עם 0.02% נתרן אזיד למשך הלילה בתא לח. לאחר ההכתמה, הכינו פתק כיסוי חדש המכונה טופר, עם תמיכות.

צרו מרווח של כ-200 מיקרומטרים, על ידי שימוש במרווחים העשויים מ-22 על 22 החלקות כיסוי, במרחק של כסנטימטר אחד זו מזו, באמצע הטופר. כדי לדבוק, צבעו את התפר של הספייסר הכי רחוק מהמרכז, בשכבה דקה של לק, ואז תנו לו להתייבש. הסר כמה שיותר מהתמיסה המימית מהדגימה, ומיד החל שתי טיפות של מדיום הרכבה נגד דהייה על הדגימה.

במידת הצורך, השתמש במלקחיים חדים ונקיים כדי למקם את הנוטום במרכז הטיפות הבינוני נגד דהייה. מניחים את החלקת הכיסוי עם הנוטום, על תמיכה של כ-10 על 40 מילימטרים בקצף כדי להעלות את הדגימה כך שלא תידבק למשטח העבודה. תחת טווח דיסקציה, הורידו באיטיות את הטופר אל המדגם.

ברגע שמדיום ההרכבה נגד דהייה פוגש את הטופר, שחררו בעדינות ואפשרו לפעולה נימירית למשוך את החלק העליון למטה. הניחו פיסת קצף נוספת על הטופר, והשתמשו בהחלקת מיקרוסקופ סטנדרטית כמשקל, כדי לשדל בעדינות את מדיום ההרכבה נגד דהייה בין החלקת כיסוי הדגימה, הטופר והמרווחים. לאחר 5-10 דקות, השתמשו ברקמה סופגת כדי לנתק כל עודף מדיום הרכבה נגד דהייה, על ידי נגיעה עדינה בשולי החלקת הכיסוי.

יש למרוח בעדינות את הלק על כל פינה במחליקי הכיסוי כדי להדביק אותם זה לזה. כדי למנוע את החלקת הכיסוי מלהזיז ולפגוע ברקמת הגב, יש להימנע תחילה מציפוי הקצוות, ולאחר שהלק בפינות מתייבש, צבעו את כל קצוות הכיסוי מחליקים לאטום. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של הדגימות הקבועות, באמצעות נוגדנים וכתמים תאיים.

פרוטוקול זה יכול לשמש על דגימות שנפצעו בעבר וצילמו בשידור חי. השוואה של תמונות חיות וקבועות, מראה כי הפרוטוקול משמר את ארכיטקטורת הרקמה ואת המורפולוגיה. הפרוטוקול מאפשר תצוגות שונות של נוטום מנותח.

התצוגה האפית אידיאלית להדמיה של גבולות תאי אפיתל וגרעינים, מתחת לציפורן. התצוגה הבסיסית חושפת טוב יותר מבנים בסיסיים בשולי הפצע. הקפד לא לכופף או לעקם את הנוטום במהלך הנתיחה.

חותכים חתיכה שטוחה על ידי הימנעות מהקצוות הצדדיים. אין לחתוך קרוב מדי לדפנות הגחון, אחרת הוא יתעוות במהלך ההרכבה. לאחר ניתוח אישון נוטום, ניתן ליישם טכניקות רבות אחרות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים וחתך רוחב.

טכניקות אלה יכולות לאפשר לחקור מבנים שצולמו בעבר בפירוט עצום.