विच्छेदन, फिक्सिंग, और ड्रोसोफिला Pupal Notum visualizing

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह आपको ड्रोसोफिला प्यूपा के नोटम पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करने की अनुमति देता है, यहां तक कि वे पहले घायल होने के बाद भी, और ऊतक की वास्तुकला को बाधित किए बिना लाइव-इमेजिंग करते हैं। यह तकनीक आपको पहले से ही उपलब्ध एंटीबॉडी दाग की विस्तृत श्रृंखला का लाभ उठाने की अनुमति देती है, कोशिकाओं, संरचनाओं और प्रोटीन को दागने के लिए, नोटम उपकला में। हमने इस तकनीक का उपयोग इम्यूनोकेमिस्ट्री, और डीएनए-स्टेनिंग के लिए किया है।

हालांकि, इस विच्छेदन का उपयोग अन्य तकनीकों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में किया जा सकता है, जैसे कि इन सीटू संकरण। यह प्रोटोकॉल मुश्किल हो सकता है, क्योंकि प्यूपा छोटे और नाजुक हैं, इसलिए विच्छेदन करने के लिए एक स्थिर हाथ की आवश्यकता होती है। और यह अनुभव के साथ आसान हो जाता है, इसलिए महत्वपूर्ण लोगों से पहले महत्वहीन प्यूपा पर अभ्यास करें।

चरण P5 पर तीन से चार प्यूपे को सावधानीपूर्वक हटाकर, विच्छेदन क्षेत्र का उपयोग करके शुरू करें, और टेप के बगल में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उन्हें इकट्ठा करें। इसके बाद, प्यूपे को कम से कम एक प्यूपा चौड़ाई के अलावा रखें, टेप पर, उनके वेंट्रल पक्षों के साथ नीचे। अब, एक parrafin फिल्म पर चिपकने वाला गोंद की एक बूंद, या एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन में जगह है।

इसके बाद, चिपकने वाले गोंद की बूंद में 0.1 से 10 माइक्रोलीटर पिपेट टिप के अंत को डुबोएं, और एक कवर स्लिप पर पिपेट टिप को दो बार टैप करें, एक कोने से एक सेंटीमीटर दूर एक सेंटीमीटर दूर, चिपकने वाले गोंद की एक रेखा बनाते हुए, प्यूपा की लंबाई का लगभग आधा। अगला, दो माइक्रोलीटर पर एक पी 2 पिपेट को प्रीसेट करें, और 200 माइक्रोलीटर वॉल्यूम पर एक पी 200 पिपेट, और उन्हें युक्तियों के साथ फिट करें। अब, सिर के किनारे के पास संदंश डालें, और धीरे से पुतली के मामले को यथासंभव हटा दें, पूर्वकाल से पीछे तक काम करें।

अगला, पिल्ला के विकासशील पैरों को समझें, कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ, और ध्यान से प्यूपा को इसके मामले से खींचें। कवर स्लिप के कोने में प्यूपा बिछाएं। पीछे के पेट, या विकासशील पंख पर प्यूपा को कुंद संदंश के साथ समझें।

उठाओ और चिपकने वाला गोंद की रेखा में, pupa के ventral पक्ष नीचे जगह. पी 2 पिपेट को जल्दी से भरें, एकल-शक्ति पीबीएस के दो माइक्रोलीटर के साथ, जिसमें 0.1 मिलीमोलर कैल्शियम होता है, और इसे हवा में पकड़कर, टिप पर एक छोटा सा बुलबुला बनाने के लिए पर्याप्त रूप से निष्कासित करता है। समाधान के छोटे बुलबुले को स्पर्श करें, वक्ष के आधार पर प्यूपा के एक तरफ, फिर दूसरी तरफ प्रक्रिया को दोहराएं।

इसके बाद, P200 पिपेट को भरें, 0.1 मिलीमोलर कैल्शियम के साथ एकल-शक्ति पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर के साथ, फिर वक्ष पर पिपेट की नोक रखें, और प्यूपे को पूरी तरह से डुबोने के लिए सामग्री को निष्कासित करें, और चिपकने वाला गोंद का शेष तुरंत ठोस हो जाएगा। अब, पीबीएस समाधान के लगभग 100 माइक्रोलीटर को हटा दें, इसलिए प्यूपा मुश्किल से डूबा हुआ है, अगले चरण में तुरंत आगे बढ़ने से पहले। नोटम को विच्छेदित करने के लिए, सूक्ष्म विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी को समझें, प्रमुख हाथ की तर्जनी उंगली और मध्य उंगली के खिलाफ हैंडल के एक तरफ ब्रेसिंग करें, इसलिए प्रमुख हाथ का अंगूठा काटने के बल को लागू करता है।

इसके बाद, गैर-प्रमुख हाथ की मध्य उंगली के खिलाफ कैंची की गर्दन को स्थिर करें, जबकि कवर स्लिप को ब्रेसिंग करते हुए, गैर-प्रमुख हाथ की अनामिका उंगली के साथ। अब, पृष्ठीय पेट के बीच में स्निप लगभग 0.2 से 0.5 मिलीमीटर का एक छोटा सा छेद बनाने के लिए। पृष्ठीय ऊतक को अलग करने के लिए, छोटे 0.5 से 0.75 मिलीमीटर तक इंटेग्यूमेंट के माध्यम से कटौती करें, पीछे से पूर्वकाल तक, और अंत में, ये पृष्ठीय ऊतक को घेर लेंगे।

इसके अलावा, pupae के दूसरी तरफ पूर्वकाल कटौती करने के लिए पीछे की ओर दोहराएँ। यदि आवश्यक हो तो सिर के माध्यम से एक साफ कटौती की अनुमति देने के लिए विच्छेदन चरण को घुमाएं। निर्धारित करें कि क्या नोटम को अलग किया गया है, यह देखकर कि क्या यह आसानी से ले जाया जाता है।

कवर स्लिप के केंद्र में एकल-शक्ति पीबीएस के लगभग 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और इसे मूल विच्छेदन बूंद से जोड़ने वाला एक चैनल बनाएं, धीरे से कवर ग्लास के पार पिपेट टिप को खींचकर, नई बूंद से मूल बूंद तक। कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, धीरे से कवर स्लिप के केंद्र में अलग-थलग नोटम को धक्का दें या खींचें और घुमाएं, इसलिए आंतरिक पक्ष ऊपर की ओर सामना करता है। पेट या सिर के अनुभाग में दबाकर, कुंद संदंश के साथ नोटम को नीचे रखें।

तेज संदंश और एकल-शक्ति पीबीएस के कोमल निष्कासन की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, 200 माइक्रोलीटर पिपेट से, मोनोलेयर उपकला को पूरी तरह से उजागर करने के लिए किसी भी शेष वसा शरीर, मांसपेशी बैंड, या हेमो लिफ्ट को हटा दें। एक बार जब ऊतक साफ हो जाता है, तो 200 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करें ताकि पीबीएस समाधान को यथासंभव हटा दिया जा सके, विच्छेदन के दायरे के साथ निगरानी की जा सके, ताकि नोटम को एस्पिरेट करने से बचा जा सके। अधिकतम तरल हटाने के बाद, एक अवशोषक ऊतक का उपयोग करें, ताकि कवर स्लिप पर चिपकने वाले गोंद, पुतली शव और अन्य मलबे के बाकी हिस्सों को सावधानीपूर्वक पोंछ सकें।

अब, 4% PFA के 150 से 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ठीक करें। और विच्छेदन की गति के आधार पर, अलग-अलग कवर स्लिप पर पहले प्यूपा के निर्धारण के दौरान एक से तीन और प्यूपे को विच्छेदित किया जा सकता है। पीएफए को हटा दें, और इसे एकल-शक्ति पीबीएस के साथ बदलें, 30 सेकंड के लिए एक बार नोटम को धोने के लिए।

यदि एंटीबॉडी धुंधला के साथ आगे बढ़ रहा है, तो एंटीजन इंट्रासेल्युलर होने पर ऊतक को पार करने के लिए एकल-शक्ति पीबीएस या पीबीएसटी में तीन पांच मिनट के वॉश करें। नमूने को एकल-शक्ति पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है, जिसमें एक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में रातभर 0.02% सोडियम एज़ाइड होता है। धुंधला होने के बाद, एक नया कवर स्लिप तैयार करें जिसे टॉपर के रूप में संदर्भित किया जाता है, समर्थन के साथ।

टॉपर के बीच में 22 से 22 कवर स्लिप्स से बने स्पेसर्स का उपयोग करके लगभग 200 माइक्रोमीटर का अंतर बनाएं, लगभग एक सेंटीमीटर की दूरी पर। पालन करने के लिए, नेल पॉलिश की एक पतली परत के साथ केंद्र से सबसे दूर स्पेसर की सीम को पेंट करें, और फिर इसे सूखने दें। नमूने से जितना संभव हो उतना जलीय समाधान निकालें, और तुरंत नमूने पर एंटी-फीका बढ़ते माध्यम की दो बूंदें लागू करें।

यदि आवश्यक हो, तो एंटी-फीका बढ़ते मध्यम बूंद केंद्र में नोटम की स्थिति के लिए साफ तेज संदंश का उपयोग करें। नोटम के साथ कवर स्लिप को रखें, नमूने को बढ़ाने के लिए लगभग 10 से 40 मिलीमीटर फोम समर्थन पर, ताकि यह काम की सतह का पालन न करे। एक विच्छेदन दायरे के तहत, धीरे-धीरे नमूने पर टॉपर को कम करें।

एक बार जब एंटी-फीका बढ़ते माध्यम टॉपर से मिलता है, तो धीरे से जारी करें, और केशिका कार्रवाई को टॉपर को नीचे खींचने की अनुमति दें। टॉपर पर फोम का एक और टुकड़ा रखें, और वजन के रूप में एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करें, नमूना कवर स्लिप, टॉपर और स्पेसर्स के बीच एंटी-फीका बढ़ते माध्यम को धीरे से मनाने के लिए। 5-10 मिनट के बाद, कवर स्लिप के किनारों को धीरे से छूकर, किसी भी अतिरिक्त एंटी-फीका बढ़ते माध्यम को दूर करने के लिए एक अवशोषक ऊतक का उपयोग करें।

धीरे से कवर स्लिप के प्रत्येक कोने के लिए नेल पॉलिश लागू करने के लिए उन्हें एक साथ पालन करें. पृष्ठीय ऊतक को स्थानांतरित करने और नुकसान पहुंचाने से कवर स्लिप को रोकने के लिए, पहले किनारों को कोटिंग करने से बचें, और एक बार जब कोनों में नेल पॉलिश सूख जाती है, तो कवर के सभी किनारों को सील करने के लिए फिसल जाता है। यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी और सेलुलर दाग का उपयोग करके निश्चित नमूनों की इमेजिंग की अनुमति देता है।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग उन नमूनों पर किया जा सकता है जो पहले घायल हो चुके हैं और लाइव-इमेज किए गए हैं। लाइव और निश्चित छवियों की तुलना से पता चलता है कि प्रोटोकॉल ऊतक वास्तुकला और आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है। प्रोटोकॉल एक विच्छेदित नोटम के विभिन्न विचारों की अनुमति देता है।

एपिकल दृश्य उपकला सेल सीमाओं और नाभिक को देखने के लिए आदर्श है, छल्ली के नीचे। बेसल दृश्य बेहतर घाव मार्जिन पर बेसल संरचनाओं को प्रकट करता है। सुनिश्चित करें कि विच्छेदन के दौरान नोटम को मोड़ना या ताना न दें।

पार्श्व किनारों से बचने के द्वारा एक सपाट टुकड़ा काटें। वेंट्रल पक्षों के बहुत करीब न काटें, अन्यथा यह बढ़ते समय विकृत हो जाएगा। एक पुतली नोटम को विच्छेदन करने के बाद, कई अन्य तकनीकों को लागू किया जा सकता है, जैसे कि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और क्रॉस-सेक्शनिंग।

ये तकनीकें पहले से इमेज की गई संरचनाओं को अत्यधिक विस्तार से जांच करने की अनुमति दे सकती हैं।