Mikrofluidikassisterad selektiv depolarisering av axonala mitokondrier

Mitokondrier är viktiga för neuronal hälsa. I många neurodegenerativa sjukdomar är axonala mitokondrier de första som lider, men det är inte klart vad som gör axonala mitokondrier så speciella. Den fluidiska tryckgradienten i kamrarna som används i detta protokoll möjliggör selektiv behandling av mitokondrionaxoner.

Detta lämnar cellkroppsprocesser ostörda och låter oss fokusera på axonal biologi. Vi visar här depolariseringen av mitokondrier med ett membranpotentialkänsligt färgämne, men denna metod kan tillämpas på många olika neuronala celltyper och fluorescerande avläsningar. För att börja, placera de kodade sex brunnsplattorna i en steril huva och tvätta dem två gånger med sterilt dubbeldestillerat vatten.

Låt plattorna torka i lutat läge i tre till fem minuter. Ta bort överflödigt vatten genom vakuumsugning eller pipettering. Blötlägg sedan mikrofluidikkammaren i 80% etanol.

Torka igen den mikrofluidiska kammaren i tre till fem minuter i ett lutat läge och ta bort överskott av etanol med en pipettspets. När den är helt torr, placera den mikrofluidiska kammaren i mitten av brunnen och plattan. Knacka försiktigt på mikrofluidikkammaren vid dess gränser och mikrogroovesektionen i mitten för korrekt fastsättning på glasplattan.

Samla först det önskade antalet dissocierade hippocampusneuroner i ett 1, 5 ml reaktionsrör. Centrifugera röret vid 1000 gånger G i fyra minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i åtta mikroliter B-27 neurobasala medier.

Dosera sedan celllösningen i kanalingången till den mikrofluidiska kammaren. Tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet genom kanalen. Använd en pipett och aspirera eventuell återstående cellsuspension vid kanalens utgång.

Inkubera den mikrofluidiska kammaren med celler i 15 till 20 minuter vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Fyll sedan den övre axonala brunnen med 50 mikroliter B-27 neurobasala medier och tryck på baksidan av plattan för att hjälpa flödet. Fyll varje brunn på soma-sidan med 150 mikroliter B-27 neurobasala medier, vilket skapar en spänningsbubbla ovanpå.

Fyll också båda brunnarna på axonalsidan med 100 mikroliter B-27 neurobasala medier vardera. Efter sju till åtta dagars in vitro-odling, se till att axonerna har vuxit genom mikrospåren och sträckts ut i axonalfacket. Tvätta enheten genom att ta bort B-27 neurobasala mediet och tillsätt 100 mikroliter förvärmt bildmedium till de övre brunnarna i både axonal- och somakanalerna.

Låt mediet strömma igenom till de nedre brunnarna. Ta bort mediet från de nedre brunnarna och eventuellt kvarvarande medium från de övre brunnarna och upprepa med nytt medium och lämna brunnarna tomma i slutet av tvätten. Tillsätt sedan 100 mikroliter fem nanomolära TMRE-utspädningar till både de somatiska och axonala toppbrunnarna.

Låt mediet strömma genom båda facken tills det finns lika stor volym i alla brunnar. Fyll på med TMRE-innehållande medium. Välj en region av intresse i det somatiska facket och följ det genom mikrospåren in i axonalfacket.

Se till att mikrospåren som avbildas i de somatiska och axonala facken är matchade med varandra. Efter att ha ändrat filnamnet, skaffa röda fluorescensbilder med 561 nanometer excitation och 625 nanometer emissionsvåglängder. Säkerställ en volymskillnad mellan soma och axonala kamrar genom att kontrollera närvaron av en spänningsbubbla på den somatiska sidan.

Ta sedan bort bildmediet från båda brunnarna på axonalsidan, förutom mediet inuti kanalen. För att inducera mitokondriell depolarisering, tillsätt 160 mikroliter 20 mikromolära antimycin A utspädda i bildmediet till den övre axonala brunnen. Låt det strömma genom kanalen tills det finns lika stor volym i båda axonala brunnarna.

Upprepa avbildningen och se till att samma positioner avbildas som under baslinjeförvärvet genom att identifiera mikrospåren. Med hjälp av detta protokoll odlades primära hippocampusneuroner i mikrofluidiska anordningar, följt av mitokondriell färgning med ett membrankänsligt färgämne, TMRE. Homogen färgning av mitokondrier observerades på båda sidor av mikrospåren, men inte i mitten.

Vid tillsats av antimycin A till axonalsidan behöll somala mitokondrier TMRE-signalen, medan fluorescensen förlorades från axonala mitokondrier Se till att ingen fukt finns kvar i brunnen eller på enheten innan du monterar enheten. Annars kommer kamrarna inte att förseglas. Med hjälp av denna metod kan vi studera effekterna av förlust av mitokondriell funktion i axon- och lokala funktioner, liksom dess inverkan på retrograd signalering och global cellöverlevnad.

Mitokondriell biogenes ansågs länge ske uteslutande i cellkroppen. Denna metod gjorde det möjligt för oss att avslöja att axonal mitokondrier skada krävde lokal översättning av kortet av proteinet PINK1.