A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Morfologisk og sammensætningsanalyse af neutrofile ekstracellulære fælder induceret af mikrobielle og kemiske stimuli
Chapters
Summary November 4th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenteres en protokol til induktion og analyse af in vitro neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er). Kvantificering af DNA, cathelicidin (LL37) og enzymaktivitet gav data, der viser variabiliteten i sammensætningen og morfologien af NET'er induceret af mikrobielle og kemiske stimuli under lignende kontrollerede forhold.
Transcript
Denne protokol demonstrerer heterogeniteten i sammensætning, struktur og morfologi af neutrofile ekstracellulære fælder, afhængigt af deres inducerende stimulus under sammenlignelige in vitro-betingelser i humane neutrofiler fra raske individer. Høj neutrofil renhed og levedygtighed opnås. Det gør det muligt at sammenligne koncentrationen af DNA, LL-37 og enzymaktivitet af myeloperoxidase, elastase og katepsin G, frigivet af neutrofile ekstracellulære fælder.
Denne protokol tillod at analysere effekten af opløselige faktorer eller cellulær kontakt eller mulige terapier eller mekanismer til lukning af produktionen af NET'er i autoimmun sygdom. Disse metoder kan hjælpe med undersøgelsen af autoimmun sygdom. På grund af den ukontrollerede cellegengivelse af NET'er og varigheden af justeringen af deres komponenter, der betragtes som biomarkører for sygdommen.
Fluorescensmikroskopi gør det muligt at fange billede af NET'er, der viser spredning af DNA i forbindelse med protein som LL37, som co-lokaliseret med mikroorganismer, der hjælper med at forstå, hvordan de ser ud. Til at begynde med skal du udføre vena punktering for at samle 10 ml perifert blod i rør indeholdende dikalium EDTA som antikoagulant. Udfør derefter standard blodbiometri og C-reaktiv proteintest for at udelukke infektion eller betændelse for at sikre prøvens kvalitet.
Centrifuger den perifere blodprøve for at fjerne det blodpladerige plasma, efterfulgt af en anden centrifugering og kassér det resterende plasma. Fortynd den resulterende erytrocyt- og leukocytpakke i en-til-en-volumenforhold med en 1X DPBS. Derefter deponeres først en milliliter 1,08 gram pr. milliliter densitetsopløsning i et sterilt 10 ml glasrør en milliliter 1,079 gram pr. milliliter densitetsopløsning.
Derefter tilsættes fire ml af den fortyndede erytrocyt- og leukocytpakke ved at hælde over væggene. Der centrifugeres uden acceleration eller deceleration for at undgå forstyrrelse af gradienten. Opsug fasen svarende til granulocytter og overfør til et andet sterilt 10 ml glasrør.
Der vaskes med fire ml 1X DPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius, og supernatanten kasseres. For at fjerne de resterende erytrocytter skal du behandle cellerne med osmotisk shock ved at tilsætte fire ml 0,2% saltopløsning. Inkuber i to minutter ved fire grader Celsius og centrifuger.
Supernatanten kasseres, og der tilsættes fire ml 0,65% saltopløsning. Inkuber i fem minutter ved fire grader Celsius for at genoprette membranintegriteten og gentag centrifugeringen. Supernatanten fjernes og cellerne opslæmmes igen i fire ml 1X DPBS for at fjerne celleaffald.
Centrifuger igen og ophvirvl cellepelleten igen i to ml kold HBSS-buffer. For at udføre en trypanblå udelukkelsestest fortyndes fem mikroliter cellesuspension i 20 mikroliter 0,4% trypanblåt. Tæl cellerne i et nyt buekammer og bestem cellelevedygtighed ved hjælp af en udelukkelsestest.
Monter derefter 5 mikroliter af celleophænget på et dias og pletter med Wrights plet i 15 sekunder. Fastgør straks prøven, vask med destilleret vand og observer morfologien under et optisk mikroskop. Derefter tilsættes en gange 10 til de femte celler for at strømme cytometrirør og pletter med en mikroliter 7AAD i 100 mikroliter FACS-buffer i 15 minutter ved fire grader Celsius i mørket.
Vask med 500 mikroliter FACS-buffer ved 300 G i 10 minutter. Fastgør cellerne med 500 mikroliter 2% paraformaldehyd og opbevar ved fire grader Celsius indtil flowcytometrianalyse. For en død cellekontrol fastgøres cellerne med 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter og vaskes med 500 mikroliter 1XPBS ved 300 G i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Supernatanten kasseres, og der tilsættes 200 mikroliter 0,1 % Triton X-100. Inkuber i en time ved fire grader Celsius. Vask med 500 mikroliter 1X PBS og plet med 7AAD.
Analyser de indfangede data i flowcytometersoftwaren. Indlæs filerne, og dobbeltklik på den ubejdsede neutrofilfilfil. Vælg fremadrettet spredning eller FSC på X-aksen og sidespredning eller SSC på Y-aksen for at få vist cellepopulationen svarende til neutrofiler.
Vælg derefter kanalen B3-A:PerCP vio 700-A på X-aksen for at afgrænse cellernes autofluorescens og vælge histogram på Y-aksen. Åbn derefter filen Stained Neutrophil. Vælg FSC på X-aksen og SSC på Y-aksen for at få vist den cellepopulation, der svarer til neutrofiler.
Vælg igen kanalen B3-A:PerCP vio 700-A for at afgrænse populationen af neutrofiler, der er positive for farvestoffet 7AAD. Generer det endelige histogram ved at højreklikke på vinduet og vælge kopier til layouteditor. Tilsæt bakterielle eller svampepseudohyfer i 1,5 ml mikrorør.
Tilsæt 200 mikroliter, så fem mikromolær CFSC i 1X PBS. Bland og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter i mørket. Stop reaktionen ved at tilsætte 500 mikroliter dekomplementeret plasma og centrifuge.
Supernatanten kasseres, og pelletsen vaskes med en milliliter 1XPBS med centrifugering. Derefter suspenderes mikroorganismerne igen i 250 mikroliter 1X PBS. Forbered 50 mikroliter alikvoter i 1,5 ml mikrorør med to gange 10 til den syvende bakterie eller to gange 10 til den femte pseudohyfer til NET-induktion.
Placer 10 x 10 millimeter sterilt glasdæksel glider i en 24-brøndplade. Dæk med 10 mikroliter 0,001% poly l-lysin i en time ved stuetemperatur og vask to gange med 100 mikroliter 1X PBS. Lufttør og bestråle med UV-lys i 15 minutter.
Udskift derefter HBSS-opløsningen af den tidligere fremstillede neutrofile suspension med RPMI 1640-medium suppleret med 10% varmedekomplementeret autologt plasma. Tilsæt 350 mikroliter af denne cellesuspension til 24-brøndpladen for en endelig koncentration på to gange 10 til den femte neutrofiler pr. Brønd. Pladen inkuberes i 20 minutter ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid for at tillade cellerne at klæbe til bunden af brøndene.
For at fremkalde nettodannelse tilsættes bakteriestimuli MOI100 og pseudohyfer ved MOI1. Tilsæt også de biokemiske stimuli og forbered en kontrol uden stimulus ved at tilsætte 50 mikroliter HBSS. Få et slutvolumen på 400 mikroliter pr. Brønd og bland på en pladeryster ved 140 RPM i 30 sekunder.
Derefter inkuberes i fire timer ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid. Efter netinduktion fjernes supernatanten fra hullerne ved omhyggelig pipettering, og cellerne fikseres med 300 mikroliter 4% paraformaldehyd i 30 minutter. Vask cellerne med 200 mikroliter 1X PBS uden centrifugering og tilsæt 200 mikroliter blokerende buffer i 30 minutter.
For LL37-plet permeabiliseres cellerne med 200 mikroliter 0,2% Triton X-100 i 1X PBS i 10 minutter og vaskes med 1X PBS to gange. Monter dækslet glider på glasskinner. DNA pletter cellerne med to mikroliter DAPI og opbevares ved minus 20 grader Celsius indtil analyse ved konfokal fluorescensmikroskopi.
De dynamiske cellulære faser blev visualiseret efter rensning af dobbeltdensitetsgradient. Den typiske neutrofile morfologi blev bekræftet ved højre farvning. Cellerne viste også optimal levedygtighed observeret ved trypanblå udelukkelse uden membranforstyrrelser.
Analyse af SSC versus FSC ved flowcytometri bekræftede en population svarende til PMN med høj cellerenhed. PMN-punktplots for ufarvede celler versus 7AAD-pletceller og deres respektive histogrammer indikerede en høj cellelevedygtighed i de nyligt isolerede neutrofiler sammenlignet med de permeabiliserede kontrolceller. Efter stimulering af neutrofilerne med kemiske og mikrobielle stimulanser blev NET'er visualiseret ved fluorescensmikroskopi ved hjælp af DNA DPI og anti-LL37.
Mikroorganismerne var forfarvet med CFSE. PMA-induceret selvmordsnetdannelse indikeret ved co-lokalisering med LL37. Mens NET'er dannet med HOCI viste mindre DNA-spredning i det ekstracellulære rum, der svarede til vital NET-dannelse.
NET induceret af svampepseudohyfer viste lave koncentrationer af DNA frigivet i det ekstracellulære rum med filamentøse strukturer, der er karakteristiske for den vitale NET-dannelse. S.aureus viste vital NET-dannelse, mens P.aeruginosa inducerede frigivelse af store koncentrationer af DNA med en uklar morfologi, der var lokaliseret sammen med LL37, hvilket indikerer selvmords-NET-dannelse. Udførelse af dobbeltdensitetsgradientmetode giver os mulighed for at opnå en høj renhed og levedygtighed af neutrofiler.
Og vi hæver vaskerne, vi undgår at beskadige strukturen af dem. Efter denne metode kan vi analysere effekten af stoffer eller celler i NET-produktion, samt om de er involveret i en eller anden mekanisme eller deres anvendelse som terapier i autoimmun sygdom.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
