Bioengineering
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Mikrogel-extrazelluläre Matrix-Komposit-Unterstützung für den eingebetteten 3D-Druck menschlicher neuronaler Konstrukte
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Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für den Freiform-eingebetteten 3D-Druck von neuralen Stammzellen in selbstheilenden, annealbaren Partikel-extrazellulären Matrixkompositen. Das Protokoll ermöglicht die programmierbare Strukturierung von miteinander verbundenen menschlichen Nervengewebekonstrukten mit hoher Genauigkeit.
Transcript
Der eingebettete 3D-Druck in SHAPE-Verbundwerkstoffen überwindet die traditionellen Einschränkungen der Biofabrikation und ermöglicht eine genaue Strukturierung von mechanisch empfindlichem Gewebe in Hydrogelen, die der nativen extrazellulären Umgebung ähneln. Die SHAPE Toolbox basiert auf einem modularen Biomaterialdesign, das einfache Änderungen in der Formulierung des Druckträgers ermöglicht. Es nutzt auch kostengünstige Materialien und zugängliche Geräte für eine einfache Anpassung durch andere Forschungsgruppen.
Dieser Ansatz kann angewendet werden, um räumlich definierte menschliche neuronale Gewebemodelle zu erstellen, um die neuronale Entwicklung und Kommunikation bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Herstellung von Calciumcarbonatlösung in Reinstwasser mit einer Konzentration von zwei Milligramm pro Milliliter. Mischen Sie es mit der Alginatlösung in gleichem Verhältnis und rühren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei 650 U/min magnetisch um.
Fügen Sie dann dieser Mischung Essigsäure im Verhältnis eins zu 500 hinzu und rühren Sie erneut über Nacht. Am nächsten Tag wird die gelierte Alginatlösung bei 15.000 U/min mit einem Homogenisator 10 Minuten lang mechanisch in Mikropartikel zerkleinert. Zentrifugieren Sie dann, um die Mikropartikel zu erhalten.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie die Partikel im DMEM, die zwei millimolare Natronlauge und 1 % Penicillin-Streptomycin enthalten. Die Farbe der Aufhängung sollte sich wieder in Rot ändern. Inkubieren Sie die Suspension über Nacht bei vier Grad Celsius.
Nach der Inkubation wird die Suspension drei Minuten lang bei 15.000 U/min homogenisiert und 10 Minuten lang bei 18.500 G zentrifugiert. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und beobachten Sie das Pellet auf dicht gepackte Alginat-Mikropartikel. Um das SHAPE-Komposit zu erzeugen, mischen Sie das Alginat-Mikropartikel-Pellet mit verdünntem und neutralisiertem Kollagen im Verhältnis zwei zu eins und pipettieren Sie es auf Eis auf und ab.
Übertragen Sie das erzeugte Verbundmaterial in eine gekühlte 24-Well-Platte. Dissoziieren Sie vor dem Drucken die zuvor kultivierten humanen neuralen Stammzellen oder hNSCs mit einer 0,025%igen Trypsinlösung für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend neutralisieren Sie das Trypsin mit dem Wachstumsmedium und zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.
Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie das Zellpellet in zwei bis drei Milliliter Nährmedium. Laden Sie mit einer stumpfen Metallnadel von 21 Gauge 100 Mikroliter dicht gepackte Alginat-Mikropartikel in die Spritze. Anschließend wird die vorbereitete Zellsuspension in eine Spritze gefüllt.
Ersetzen Sie zum Drucken die Ladenadel durch eine stumpfe Metallnadel mit 27 Gauge. Sobald die zu druckende Struktur entworfen wurde, klicken Sie unter Verwendung der referenzierten Software auf Generieren für eine G-Code-Generierung. Führen Sie die zellbeladene Spritze in einen volumetrischen Extrusionskopf auf einem extrusionsbasierten Bioprinter ein und notieren Sie die Nadellänge, indem Sie auf Nadellängenmessvorgang starten klicken.
Legen Sie dann die mit SHAPE Composite bestückte 24-Well-Platte auf den Drucker und klicken Sie auf SHM, um die Höhe der leeren Well-Oberfläche zu messen. Wählen Sie pH 2 gefolgt vom Schraubenschlüsselsymbol. Ändern Sie dann unter dem Parametersatz den Volumenstrom auf 3,6 Mikroliter pro Sekunde und drücken Sie Parameter anwenden, gefolgt von Speichern und Fertig.
Laden Sie den G-Code in die Benutzeroberfläche des Druckers, indem Sie auf ein Symbol zum Öffnen des G-Codes klicken. Wählen Sie das Symbol für das laufende Programm aus, um den Druckvorgang zu starten. Unmittelbar nach dem Druck wird das SHAPE-Gel bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten zum Ausglühen inkubiert.
Geben Sie dann vorsichtig das Nährmedium auf den geglühten SHAPE-Gelträger. Entfernen Sie für die Immunfärbung das überschüssige Medium aus dem Gel und überführen Sie das Gel mit einem Spatel in einen Behälter mit DPBS. Sobald die Platte im Abzug platziert ist, entfernen Sie das DPBS.
Bedecken Sie das Gel mit 4%iger Formaldehydlösung und inkubieren Sie es eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen mit DPBS die Blockierlösung in das Gel geben. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig und inkubieren Sie sie sechs Stunden lang bei Raumtemperatur, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.
Sobald die blockierende Lösung entfernt ist, fügen Sie den primären Antikörper dem Gel hinzu und rocken Sie es vorsichtig. Inkubieren Sie die Platte 48 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Behandeln Sie das Gel nach der DPBS-Wäsche 24 Stunden lang ebenfalls mit der sekundären Antikörperlösung.
Geben Sie das gefärbte Gel vor der Bildgebung mit einem Spatel in eine Well-Platte mit einem dünnen Bildboden. In der vorliegenden Studie druckte die hNSC-Tinte ein Filament aus Zellen mit einem Durchmesser von etwa 200 Mikrometern. Die gedruckten Stränge waren reich an lebensfähigen Zellen mit einer umgebenden Morphologie.
Nach 30 Tagen des Druckens zeigten die Zellen eine neuronale Morphologie mit kleinen Zellkörpern und langen, dünnen Fortsätzen, was auf die erfolgreiche Differenzierung von hNSCs hindeutete. Die Färbung mit Tubulin beta drei ermöglichte die Visualisierung der erzeugten neuronalen Netze bei gleichbleibender Geometrie. Und während des Differenzierungsprozesses wanderten die Zellen nicht aus den gedruckten Strängen heraus.
SHAPE-Komposit kann verwendet werden, um perfusible Kanäle zu erzeugen, indem Opfertinte anstelle von Zellen gedruckt wird. Darüber hinaus kann der Träger sauerstoffempfindliche Kügelchen enthalten, um die Sauerstoffspannung in 3D-gedruckten Strukturen über Zeit und Raum zu überwachen.
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